Sphingomyelin türler Sphingomyelin LC-MS iki kararlı Isotopically kullanarak tarafından için nicel ve nitel yöntemi etiketli
Summary
Burada, bir protokol ölçmek ve birden çok tepki izleme kullanarak her sphingomyelin tür hak ve MS/MS/MS modu, sırasıyla mevcut.
Abstract
Biz sphingomyelin (SM) niteliksel çözümleme ve kantitatif sıvı Kromatografi-electrospray iyonlaşma-tandem kütle spektrometresi (LC-ESI-MS/MS) tarafından bir yöntem mevcut. SM bir phosphorylcholine ve bir ceramide hidrofilik ve hidrofobik bileşeni olarak sırasıyla oluşan bir ortak sphingolipid var. SM türlerinin sayısı sphingoid uzun zincirli temel (LCB) içinde a değişiklik nedeniyle memeli hücreleri mevcut ve bir N-asil yan ceramide içinde. Bu raporda, biz karbon ve çift bağı bir LCB ve bir Nsayısı tahmin etme yöntemi gösterir-asil yan onların karşılık gelen ürün iyonları MS/MS/MS (MS3) deneylerde dayalı. Buna ek olarak, biz bir kantitatif analiz yöntemi SM için SM Nefelometri içinde kullanılan aralığını belirleme kolaylaştıran iki kararlı isotopically etiketli SM türler, kullanarak mevcut. Mevcut yöntemi SM tür biyolojik örnekler ve kozmetik gibi endüstriyel ürünlerin çeşitli karakterize faydalı olacaktır.
Introduction
Sphingomyelin (SM) memeli hücrelerinde ortak bir sphingolipid var. Sphingosine-1-fosfat ve bir ceramide bağışıklık içinde çok önemli rolleri olan kaçakçılığı hücre ve bariyer Homeostazı, sırasıyla2deri gibi SM sentezlenmiş intracellularly1 ve diğer organizmalardandır için bir habercisi olarak hediye. 3. Böylece, SM metabolizma kesin analizini organizmalardandır fizyolojik ve patolojik rolleri elucidating için önemlidir.
SM bir ceramide ve daha da bir sphingosine ve bir Noluşan ceramide 1-hidroksi grubuna bağlı bir phosphorylcholine oluşur-asil yan. Sphingosine ve Nkarbon ve çift bağ sayıları içinde a değişiklik-asil yan sonuç sütun sayısı ve ceramide (SM) tür. Son gelişmeler LC-ESI-MS/MS / SM4,5nicel ve nitel analiz sağladı. Kalitatif analiz, karbon sayısı ve çift bağı bir sphingoid SM LCB ürün iyon spectra LCB in atayarak tespit edilmiştir. Ancak, yapısal bilgi N-asil yan doğrudan elde değil onun karşılık gelen ürün iyonları rapor değil çünkü ve bu nedenle N-asil moieties habercisi iyonlar arasındaki fark analizi tarafından sonuca vardım ve Ürün iyonları LCB için her iki pozitif ve negatif iyon modları4,5‘ te karşılık gelen. Bu raporda, biz ürün iyonları LCB ve Nalgılamak için bir yöntem mevcut-asil yan triple quadrupole ve hassas yapısal kolaylaştırır quadrupole doğrusal iyon kapanı kütle spektrometresi kullanılarak modunda aynı anda MS3 spekülasyon her SM türler6.
Biyolojik örnekler matrisinde neden iyon bastırma (veya geliştirme) etkileri LC-ESI-Bayan analizi doğru miktar engel ve bu nedenle, aynı matris ilgi bütün analitler için kalibrasyon eğriler oluşturmak için arzu edilir biyolojik örneği. Ancak, hemen hemen bütün SM türlerin biyolojik örneklerde, özellikle de kapsamlı bir analiz hazırlamak mümkün olduğundan bu strateji mümkün değil. Böylece, bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak ve biyolojik örneklerde çivili bir temsilcisi SM türler kullanarak sayısal Aralık belirlemek pratiktir. İki isotopically etiketli SM türler bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılan; bir dahili bir standart diğeri bir standart bileşik kullanıldı. Küçük bir miktar isotopically etiketli SM türlerin biyolojik örnekleri çivili ve başarıyla bir kalibrasyon eğrisi ve nicel aralığı6elde edilen standart bir bileşik tespit ettik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut nitel yöntemde, biz MS3 ürün iyonları bir SPC ve bir Nelde edilen-asil yan. Düzgün bir SPC ve bir Natamak için önemlidir-asil yan. Bu amaçla, bu diğer phosphorylcholine içeren moleküller de MS3 ürün iyonları tespit edilebilir olması gerekmektedir. Diacyl-phosphatidylcholine (PC) ve plasmalogen-PC bol memeli hücrelerinde varsa ve onların hydrophobicity SM benzemektedir. Bu nedenle, diacyl-PC ve plasmalogen-PC ile bir izotop (genellikle 13C) teorik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve teknoloji, Japonya (KAKENHI) K.H. (#15 K 01691) için Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) ve bir hibe Bakanlığı inatçı hastalığı projeden incelenmesi için bir araştırma hibe tarafından desteklenmiştir Sağlık, iş gücü ve refahı (K.Y. #201510032A). Edanz grubu (www.edanzediting.com/ac) bu yazının taslağını düzenleme için teşekkür ediyoruz.
Materials
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| 100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
| Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
| Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
| Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
| Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
| CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
| CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
| Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
| Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
| 2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
| Methanol | Wako | 134-14523 | |
| Formic acid | Wako | 066-00466 | |
| 28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
| Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
| Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
| 1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
| 8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
| Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
| Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
| PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
| The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
| The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
| HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
| Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
| d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
| Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
| Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
| Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |
References
- Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
- Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
- Kihara, A. Synthesis and degradation pathways, functions, and pathology of ceramides and epidermal acylceramides. Prog Lipid Res. 63, 50-69 (2016).
- Merrill, A. H., Sullards, M. C., Allegood, J. C., Kelly, S., Wang, E. Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods. 36 (2), 207-224 (2005).
- Houjou, T., et al. Rapid and selective identification of molecular species in phosphatidylcholine and sphingomyelin by conditional neutral loss scanning and MS3. Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (24), 3123-3130 (2004).
- Hama, K., Fujiwara, Y., Tabata, H., Takahashi, H., Yokoyama, K. Comprehensive Quantitation Using Two Stable Isotopically Labeled Species and Direct Detection of N-Acyl Moiety of Sphingomyelin. Lipids. , (2017).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Gu, H., Liu, G., Wang, J., Aubry, A. F., Arnold, M. E. Selecting the correct weighting factors for linear and quadratic calibration curves with least-squares regression algorithm in bioanalytical LC-MS/MS assays and impacts of using incorrect weighting factors on curve stability, data quality, and assay performance. Anal Chem. 86 (18), 8959-8966 (2014).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Thomas, M. C., et al. Ozone-induced dissociation: elucidation of double bond position within mass-selected lipid ions. Anal Chem. 80 (1), 303-311 (2008).
- Baba, T., Campbell, J. L., Le Blanc, J. C., Baker, P. R. In-depth sphingomyelin characterization using electron impact excitation of ions from organics and mass spectrometry. J Lipid Res. 57 (5), 858-867 (2016).
- Ryan, E., Nguyen, C. Q. N., Shiea, C., Reid, G. E. Detailed Structural Characterization of Sphingolipids via 193 nm Ultraviolet Photodissociation and Ultra High Resolution Tandem Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. , (2017).
- Pham, H. T., Ly, T., Trevitt, A. J., Mitchell, T. W., Blanksby, S. J. Differentiation of complex lipid isomers by radical-directed dissociation mass spectrometry. Anal Chem. 84 (17), 7525-7532 (2012).
