כאן, אנו מציגים בפרוטוקול כדי לכמת ויגדיר לכל מין ספינגומיילין באמצעות ניטור התגובה מרובים ומצב MS/MS/MS, בהתאמה.
אנו מציגים שיטה של ניתוח ספינגומיילין (SM) איכותית, באופן כמותי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-ESI-MS/MS). SM הוא ספינגוליפיד משותף מורכב של phosphorylcholine של ceramide כרכיב הידרופיליות, הידרופוביות, בהתאמה. מספר מינים SM נמצאים בתאי יונקים בשל מגוון רחב של sphingoid ארוך רשת בסיס (LCB) N-moiety ליפיד ב- ceramide. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה להערכת המספר של פחמן קשרים כפולים LCB, N-moiety ליפיד המבוסס על יונים המוצר המקביל שלהם בניסויים MS/MS/MS (MS3). בנוסף, אנו מציגים שיטת ניתוח כמותי ס באמצעות שני יציב isotopically שכותרתו SM מינים, אשר מקלה על קביעת הטווח בשימוש SM כימות. השיטה הנוכחית יהיה מועיל באפיון מגוון מינים SM דגימות ביולוגיות ומוצרים תעשייתיים כגון מוצרי קוסמטיקה.
ספינגומיילין (SM) הוא ספינגוליפיד נפוצות בתאים בתרבית. SM היא מסונתז intracellularly1 ומתנת כמבשר sphingolipids אחרים כגון sphingosine-1-פוספט ו- ceramide של, אשר יש תפקיד מכריע החיסון תא סחר ועור מכשול הומאוסטזיס, בהתאמה2, 3. לפיכך, ניתוח מדויק של החומרים SM חשוב שחקרתי את התפקידים פיזיולוגיים ופתולוגיים של sphingolipids.
SM מורכבת של ceramide phosphorylcholine מקושרת קבוצת ceramide, אשר מורכב עוד יותר sphingosine Nהידרוקסי 1-acyl השומן moiety. מגוון את המספרים פחמן, הקשר הכפול הן sphingosine והן N-moiety ליפיד מתבטא המין מספר ceramide (SM). התפתחויות אחרונות LC-ESI-MS/MS איפשר ניתוח כמותי ואיכותי של SM4,5. בספירת הדם, המספר של פחמן ו כפולים של sphingoid LCB של SM זוהה על-ידי הקצאת המוצר ספקטרום יון של LCB. עם זאת, במידע המבני N-acyl השומן moiety לא ישירות הושג כי יונים המוצר המקביל שלו לא דווחו, ולכן N-acyl השומן moieties היו להסיק על ידי ניתוח ההפרש בין יונים קודמן ו יונים של המוצר המתאים LCB שני יונים חיוביים ושליליים מצבי4,5. בדו ח זה, אנו מציגים שיטה לגילוי היונים מוצר של LCB ו- N-moiety ליפיד בו-זמנית במצב MS3 באמצעות פאול משולשת, פאול מלכודת יונים ליניארי ספקטרומטר מסה, המאפשרת את מבני מדויק ספקולציות של כל המינים SM6.
יון דיכוי (או שיפור) ההשפעות שנגרמו על ידי המטריקס בדגימות ביולוגיות ה”בלתי כימות מדויק בניתוח LC-ESI-MS, לכן רצוי לבנות עקומות כיול עבור analytes כל עניין המטריצה זהים המדגם ביולוגי. עם זאת, אסטרטגיה זו הוא לא ריאלי כי זה כמעט בלתי אפשרי להכין את כל המינים SM בדגימות ביולוגיות, במיוחד בניתוח מקיף. לכן מעשית לבנות עקומת כיול ולקבוע טווח כמותית באמצעות זן SM נציג עלה בדגימות ביולוגיות. היינו שני מינים של SM isotopically התווית על-ידי בניית עקומת כיול; אחד שימש תקן פנימי והשני עבור תקן מורכבים. גילינו כמות קטנה של מינים SM isotopically שכותרתו כמו תרכובת רגילה עלה בדגימות ביולוגיות והשיג בהצלחה עקומת כיול ו טווח כמותי6.
בשיטה איכותית נוכח, השגנו MS3 המוצר יונים SPC, N-moiety ליפיד. זה קריטי להקצות כראוי SPC והן N-acyl השומן moiety. לשם כך, יצוין כי מולקולות אחרות המכילות phosphorylcholine ניתן לזהות גם כמו MS3 המוצר יונים. פלסמלוגן-PC ו- Diacyl-phosphatidylcholine (PC) נמצאים בשפע בתרבית של תאים, hydrophobicity שלהם דומה לזה של SM. לכן…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך, תרבות, ספורט, המדע, הטכנולוגיה של יפן (KAKENHI) כדי בעדותה (#15 K 01691), שפורחים (#15 K 08625), K.Y. (#26461532), מענק לצורך המחקר של פרוייקט סורר המחלה של משרד בריאות, העבודה והרווחה (K.Y. #201510032A). אנו מודים קבוצת Edanz (www.edanzediting.com/ac) על עריכת טיוטה של כתב היד הזה.
PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
100 mm tissue culture dish | IWAKI | 3020-100 | |
Cell scraper | IWAKI | 9000-220 | |
Siliconized 2.0 mL tube | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
Test tube | IWAKI | TST SCR 16-100 | |
Teflon-lined screw cap | IWAKI | 9998CAP415-15 | |
Disposable glass tube | IWAKI | 9832-1310 | |
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mm | Shiseido | 92223 | Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column |
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGE | Shiseido | 12197 | |
Cartridge holder | Shiseido | 12415 | |
Acetonitrile | Wako | 018-19853 | |
2-Propanol (Isopropyl Alcohol) | Wako | 161-09163 | |
Methanol | Wako | 134-14523 | |
Formic acid | Wako | 066-00466 | |
28% Ammonia water | Wako | 016-03146 | |
Sonicator (bath type) | SHARP | UT-206H | |
Vortex mixer for glass test tube | TAITEC | Mix-EVR | |
1.4 mL glass vial | Tomsic | 500-1982 | Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C |
8 mm septum | Tomsic | 200-3322 | When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum |
Screw cap for 1.4 mm glass vial | Tomsic | 500-2762 | |
Screw cap with slit septum | Shimadzu GLC | GLCTV-803 | |
PVDF 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometry | SCIEX | QTRAP4500 | |
The software for data acquisition and analysis of product ion spectra | SCIEX | Analyst | |
The software for data integration in quantitative analysis | SCIEX | MultiQuant | |
HPLC system | Shimadzu | Nexera | |
Glass bottle | Sansyo | 85-0002 | |
d18:1/24:0 sphingomyelin | Avanti Polar Lipids | 860592P | |
Sphingosylphosphorylcholine | Merck | 567735 | |
Fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
L-glutamine | ThermoFisher | 25030081 | |
Penicillin and streptomycin | Sigma | P4333 | |
Eagle’s minimum essential medium | Sigma | M4655 |