Summary

Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

Published: March 28, 2018
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Summary

Deux différentes 3′ amplification rapide des extrémités d’ADNc (3′ course) protocoles décrit ici faire usage de deux différents ADN polymérases pour mapper les séquences qui incluent une partie de la trame de lecture ouverte (ORF), le codon d’arrêt et l’entière région 3′ UTR de transcription utilisant l’ARN issus de lignées de cellules cancéreuses différent.

Abstract

La maturation des ARNm eucaryotes implique 3′ fin formation qui implique l’addition d’une queue poly (a). Afin de cartographier l’extrémité 3′ d’un gène, la méthode traditionnelle de choix est 3′ amplification rapide des extrémités d’ADNc (3′ RACE). Protocoles pour 3′ RACE nécessitent la conception soignée et la sélection des amorces imbriquées au sein de la région 3′ non traduite (3′ UTR) du gène cible d’intérêt. Cependant, avec quelques modifications, le protocole peut être utilisé pour inclure l’entière région 3′ UTR et séquences dans le cadre de lecture ouvert (ORF), fournissant une image plus complète de la relation entre l’ORF et la région 3′ UTR. Il s’agit en plus d’identifier le signal de polyadénylation (Fe), ainsi que le site de clivage et polyadénylation fourni par classiques 3′ RACE. Expansé 3′ RACE peut détecter insolite 3′ UTR, y compris des fusions de gènes au sein de la région 3′ UTR, et les informations de séquence peuvent être utilisées pour prédire le potentiel miRNA accepteurs comme AU riche déstabiliser les éléments qui peuvent affecter la stabilité de la transcription.

Introduction

La formation de l’extrémité 3′ est une étape cruciale dans la maturation des ARNm qui comprend le clivage de l’ARN pré-messager en aval d’un PAS suivie par l’ajout de ~ 250 untemplated adénines, qui forment la queue poly (a)1,2. La protéine de liaison de poly (a) (PABP) se lie à la queue poly (a), et cela protège la transcription de l’ARNm de la dégradation et facilite la traduction1.

Les estimations actuelles suggèrent que 70 % des gènes humains ont plusieurs PASs et donc subir une alternative polyadénylation, entraînant plusieurs extrémités de 3′3. Ainsi, il est important d’identifier où la queue poly (a) s’adapte sur le reste de la région 3′ UTR, en plus d’identifier les FE utilisés par toute transcription donnée. L’avènement de la nouvelle génération de séquençage a entraîné l’identification simultanée de la 3′ UTR et le col de milliers de gènes. Cette augmentation de capacité de séquençage a nécessité le développement d’algorithmes bioinformatiques pour analyser les données impliquant la polyadénylation alternative de l’extrémité 3′. Pour la détection de novo ou la validation du PAS et par conséquent de cartographie de l’extrémité 3′ des gènes individuels de données de séquençage à grande échelle, 3′ RACE reste la méthode de choix4,5. Les séquences incluses dans les produits de cDNA de 3′ course normalement n’incluent qu’une partie de la région 3′ UTR qui contient la queue poly (a), le site de clivage, le PAS et les séquences en amont du PAS. Contrairement à la PCR, qui requiert la conception et l’utilisation des amorces spécifiques et inverses de gène, 3′ RACE ne nécessite que deux gènes imbriqué avant des amorces spécifiques. Par conséquent, PCR requiert une connaissance plus détaillée de la séquence nucléotidique d’une grande région du gène étant amplifiés4,6. Depuis 3′ RACE utilise le même inverser apprêt que cibles la poly (a) la queue pour les transcriptions polyadénylé RNA, seulement les amorces avant doivent être gène spécifique, ainsi, exigeant seulement la connaissance d’une région beaucoup plus petite de l’ARNm. Cela permet l’amplification des régions dont les séquences ne sont pas complètement caractérisé4,7. Cela a permis à 3′ course permettant non seulement de déterminer l’extrémité 3′ d’un gène, mais également déterminer et caractériser les grandes régions en amont du PAS qui forment une partie importante de la région 3′ UTR. En combinant 5′ course avec la mis à jour le 3′ course qui comprend des portions plus importantes de la région 3′ UTR et régions adjacentes, on peut pleinement séquence ou cloner une toute transcription ARNm de l’extrémité 5′ à son extrémité de 3′8.

L’identification récente d’un roman CCND1-MRCK transcription de gène fusion de lignées de cellules de lymphome du manteau et de patients atteints de cancer en est un exemple de cette demande de mis à jour le 3′ RACE. La région 3′ UTR consistait en des séquences de gènes les CCND1 et MRCK et était récalcitrant à miRNA règlement9. Les deux imbriqués CCND1 avant des amorces spécifiques sont complémentaires dans la région immédiatement adjacente et en aval du codon CCND1 . Bien que le séquençage de transcriptome entier ainsi que des outils bioinformatiques spécifique peut être utilisé pour détecter des fusions de gènes au sein de la 3′ UTR10, nombreux laboratoires peuvent n’ont pas les ressources financières ou l’expertise de bioinformatique pour faire usage de cette technologie. 3′ RACE est donc une alternative pour l’identification de novo et la validation des gènes de roman fusion impliquant la région 3′ UTR. Considérant la drastique augmentation du nombre de gènes de fusion signalés ainsi que de lire par l’intermédiaire de transcriptions, 3′ RACE est devenu un outil puissant pour la caractérisation des séquences de gène11,12. En outre, des études récentes ont montré que différentes séquences au sein de la région 3′ UTR ainsi que la longueur de la région 3′ UTR peut affecter mRNA stabilité de transcription, localisation, traduisibilité et fonction13. Due en partie à un intérêt accru dans la cartographie du transcriptome, il y a eu une augmentation du nombre des différents ADN polymérases, en cours d’élaboration pour une utilisation en laboratoire. Il est important de déterminer quels types de modifications peuvent être apportées à la 3′ Protocole de course en afin d’utiliser le répertoire disponible des ADN polymérases.

Ce travail rapports adaptation 3′ course de cartographier l’ensemble 3′ UTR, les FE et 3′ fin site de clivage de la transcription de ANKHD1 à l’aide d’imbriqués amorces au sein de la section ANKHD1 de la transcription et deux différents ADN polymérases.

Protocol

Porter une blouse, des gants et des lunettes de sécurité en tout temps lors de l’exécution de toutes les procédures dans le présent protocole. S’assurer que les contenants/tubes contenant le réactif de l’isothiocyanate de phénol et de guanidine sont ouverts uniquement dans une hotte certifiée et éliminer les déchets de phénol dans un conteneur désigné. Utiliser des réactifs, des conseils et des tubes stériles DNAse/RNAse-libre. 1. Culture cellulaire Cultiver la l…

Representative Results

Recherche de Primer avant imbriqués : Le gel d’agarose La figure 1 montre deux produits distincts du gel PCR (pistes 1 et 2) qui utilisent le même avant apprêt mais différentes amorces inverses. Lane 3 a un produit PCR distinct et une amorce et inverse distincte. Les amorces idéales à utiliser pour la réaction PCR basé sont ceux qui donnent un produit PCR distinct (voie 3). …

Discussion

Malgré l’avènement des technologies de séquençage parallèle massive, sur une base de gène par gène, 3′ RACE reste la méthode la plus facile et plus économique pour identifier les PAS et les nucléotides adjacents à la queue poly (a). L’adaptation décrite ici développe en utilisant 3′ course à amplifier et carte des séquences qui incluent une partie de l’ORF, le codon d’arrêt et l’entière région 3′ UTR de la transcription ARNm de ANKHD1 . Un avantage majeur de la 3′ RACE est que, avec q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Bettine Gibbs pour son aide technique.

Materials

HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

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Cite This Article
Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3′ Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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