Summary

암에 성적표를 매핑할 CDNA의 급속 한 확대 끝 적응 3'

Published: March 28, 2018
doi:

Summary

CDNA 끝 (3′ 경주)의 두 개의 서로 다른 3′ 급속 한 확대 프로토콜 설명된 여기 확인 지도 열려있는 독서 프레임 (ORF), 정지 codon 그리고는 전체 3′ UTR RNA를 사용 하 여 증명서의 세그먼트를 포함 하는 시퀀스를 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 사용 다른 암 세포 선에서 얻은.

Abstract

진 핵 mRNAs의 성숙 3′ 끝 형성을, 많은 꼬리의 추가 포함 하는 포함 한다. 유전자의 3′ 끝, 지도 하기 위하여 선택의 전통적인 방법은 cDNA 끝 (3′ 경주)의 3′ 급속 한 확대 이다. 3′ 레이스에 대 한 프로토콜 설계 및 관심의 대상 유전자의 3′ 되지 않은 지역 (3′ UTR) 내에서 중첩 된 뇌관의 선택을 요구 한다. 그러나, 몇 가지 수정 프로토콜 포함 전체 3′ UTR 및 ORF와 3′ UTR 사이의 관계의 더 포괄적인 그림을 제공 하는 열려있는 독서 프레임 (ORF), 내에서 시퀀스를 사용할 수 있습니다. 이것은 기존의 3′ 경쟁에서 제공 하는 분열 polyadenylation 사이트 뿐만 아니라 polyadenylation 신호 (PA)의 외 이다. 특이 한 3′ Utr, 3′ UTR, 내 유전자 융해를 포함 하 여 검색할 수 있습니다 확장 된 3′ 경주 그리고 시퀀스 정보 잠재적인 미르 바인딩 사이트 뿐만 아니라, 누구나 풍부한 사본의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 요소를 불안정을 예측에 사용할 수 있습니다.

Introduction

3′ 끝의 형성은 사전-mRNA의 하류 ~ 250 untemplated adenines 많은 꼬리1,2를 구성 하는 추가 다음 파의 분열을 구성 하는 mRNA 성숙에 중요 한 단계입니다. 많은 의무적인 단백질 (PABP) 많은 꼬리를 한다이 저하에서 mRNA 사본 보호 하 고 번역1을 용이 하 게 한다.

현재 견적 인간 유전자의 70% 여러 패스, 따라서 여러 3′ 끝3인 양자 택일 polyadenylation 받아야 좋습니다. 따라서, 많은 꼬리의 3′ UTR, 나머지 연결 식별 어떤 주어진된 대 본에서 사용 하는 파를 식별 하는 것이 중요 하다. 차세대 시퀀싱의 출현 Utr 및 유전자의 수천의 패스의 3′ 동시 식별에 결과 있다. 시퀀싱 기능에 있는이 증가 bioinformatic 3′ 끝의 양자 택일 polyadenylation 관련 데이터를 분석 하는 알고리즘의 개발을 요구 했다. 드 노 보 탐지 또는 유효성 검사는 파의 및 그러므로 대규모 시퀀싱 데이터에서 개별 유전자의 3′ 끝의 매핑, 3′ 경주 남아 선택4,5의 방법. 3′ 경주의 cDNA 제품에 일반적으로 포함 하는 시퀀스의 3′ UTR 많은 꼬리, 분열 사이트, 우선권, 및 상류는 파의 순서에 있는 부분에만 포함 됩니다. 디자인 및 유전자 특정 앞으로 역 뇌관의 사용 필요, PCR와 달리 3′ 레이스만 요구 한다 2 개의 유전자 특정 중첩된 앞으로 뇌관을. 따라서, PCR 증폭된4,6되 고 유전자의 큰 영역의 뉴클레오티드 순서의 더 상세한 지식이 필요 합니다. 3′ 레이스 사용 같은 뇌관 그 목표는 많은 모든 polyadenylated RNA 사본에 대 한 꼬리, 앞으로 뇌관 될 필요가 유전자 특정, 따라서,만 요구 하는 mRNA의 크게 작은 영역의 지식 역. 그 시퀀스는 완전히 특징이4,7영역의 확대 수 있습니다. 이 수 있다 3′ 경주 뿐만 아니라, 유전자의 3′ 끝을 결정 하지만 또한 결정 하 고 큰 지역 상류의 3′ UTR 상당 부분을 형성 하는 파의 특성 사용. 5’는 수정 3′ 3′ UTR의 큰 부분 및 측면에 서 지구를 포함 하는 레이스와 레이스를 결합 함으로써 완전히 순서 또는 그것의 3′ 끝85′ 끝에서 한 전체 mRNA 사본 복제 가능 하다.

이 응용 프로그램의 수정 3′ 레이스의 예는 소설 CCND1 MRCK 융합 유전자 사본 맨 틀 세포 림프 종 세포 선 암 환자에서의 최근 id입니다. 3′ UTR CCND1 MRCK 유전자에서 시퀀스의 구성 그리고 미르 규정9완강히 저항 했다. 두 개의 중첩 된 CCND1 특정 앞으로 뇌관 즉시 인접 하 고 CCND1 정지 codon의 하류 지역에 보완 했다. 금융 자원 또는 수 있도록 bioinformatic 전문 많은 연구소 있습니다 부족 특정 bioinformatic 도구 함께 전체 transcriptome 시퀀싱 3′ UTR10유전자 융해를 감지 사용할 수 있습니다, 있지만이 기술의 사용. 따라서, 3′ 레이스 드 노 보 식별 및 소설 퓨전 유전자 포함 3′ UTR의 유효성 검사에 대 한 대안 이다. 고려는 과감 한 보고 융합 유전자의 수에 있는 증가 뿐 아니라 성적 증명서를 통해 읽기, 3′ 경주 되고있다 유전자 시퀀스11,12특성화에 강력한 도구. 또한, 최근 연구의 3′ UTR 길이 뿐 아니라 3′ UTR에서 서로 다른 시퀀스를 영향을 미칠 수 mRNA 사본 안정성, 현지화, translatability, 및 기능13나타났습니다. 때문에 부분 관심 증가 transcriptome 매핑, 실험실에서 사용 하기 위해 개발 되 고 다른 DNA polymerases의 증가 되었습니다. 그것은 어떤 유형의 수정 할 수 있다 3 ‘ 경주 프로토콜에서 DNA polymerases 사용할 수 있는 레 퍼 토리를 활용 하기 위해서는 결정 해야 합니다.

이 작품 보고 적응 3′ 경주에 매핑하는 전체 3′ UTR, 우선권, 및 3′ 끝 분열의 사이트를 사용 하 여 ANKHD1 사본 중첩 사본 및 두 개의 서로 다른 DNA polymerases의 ANKHD1 섹션에서 뇌관.

Protocol

이 프로토콜에서 모든 절차를 수행 하는 동안 항상 실험실 외 투, 장갑, 그리고 안전 유리를 착용. 용기/튜브 포함 된 페 놀 및 guanidine isothiocyanate 시 약만 인증된 후드, 그리고 지정 된 컨테이너에 페 놀 폐기물의 처분에 열려 있는지 확인 합니다. 무 균 튜브 DNAse/RNAse 무료, 팁, 그리고 시 약을 사용 합니다. 1. 세포 배양 헬러 세포 선 및 두 정지 맨 틀 세포 림프 종 셀 라?…

Representative Results

중첩 된 앞으로 뇌관 검색: Agarose 젤에서 그림 1 에서는 두 가지 PCR 젤 제품 (1, 2 차선)는 사용 같은 전달 하지만 다른 역방향 뇌관 뇌관. 레인 3 뚜렷한 PCR 제품 고 뚜렷한 정방향 및 역방향 뇌관을 있다. 기반으로 하는 PCR 반응에 사용할 이상적인 뇌관은 하나의 뚜렷한 PCR 제품 (3 차선) 하는 그. ?…

Discussion

대규모 병렬 시퀀싱 기술, 유전자에 의해 유전자 기준의 출현에도 불구 하 고 3′ 경주 여전히 남아 있다 파 및 많은 꼬리에 인접 한 뉴클레오티드를 식별 하기 위해 쉽고 가장 경제적인 방법. 여기에 설명 된 적응을 증폭 ORF, 정지 codon 그리고는 전체 3′ UTR ANKHD1 mRNA 사본 중의 일부를 포함 하는 시퀀스를 지도 3′ 레이스 사용 하 여 확장 합니다. 3′ 경주의 주요 이점은 그 몇 가지 사소한 조정으로…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 그녀의 기술 도움 Bettine 깁스를 인정 하 고 싶습니다.

Materials

HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

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Cite This Article
Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3′ Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

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