Anpassung der 3' endet rasche Verstärkung der CDNA Transkripte in Krebs zuordnen

Summary

Die zwei verschiedenen 3′ schnelle Verstärkung der cDNA enden (3′ Rennen) Protokolle beschrieben hier machen Verwendung von zwei verschiedene DNA-Polymerasen Sequenzen zuordnen, die ein Segment der offenen Leserahmen (ORF), das Stopp-Codon und die gesamte 3′ UTR eine Niederschrift mit RNA enthalten aus verschiedenen Krebszelllinien gewonnen.

Abstract

Reifung der eukaryontischen mRNAs beinhaltet 3′ Ende Bildung, beinhaltet die Zugabe eines Poly-Schwanzes. Um die 3′-Ende eines Gens abbilden zu können, ist die traditionelle Methode der Wahl 3′ schnelle Verstärkung der cDNA enden (3′ Rennen). Protokolle für 3′ Rennen erfordern sorgfältige Planung und Auswahl der verschachtelten Primer innerhalb der 3′ untranslatierten Region (3′ UTR) des Zielgens von Interesse. Mit ein paar Modifikationen kann jedoch das Protokoll verwendet werden, um die gesamte 3′ UTR und Sequenzen innerhalb der offenen Leserahmen (ORF), bietet ein noch umfassenderes Bild der Beziehung zwischen dem ORF und der 3′ UTR. Dies ist neben der Kennzeichnung Polyadenylation Signal (PAS), sowie der Spaltung und Polyadenylation Website von herkömmlichen 3′ Rennen zur Verfügung gestellt. Erweiterte 3′ Rennen erkennt ungewöhnlichen 3′ wo, einschließlich gen Fusionen innerhalb der 3′ UTR, und die Sequenzinformation kann verwendet werden, um vorherzusagen, potenzielle MiRNA Bindungsstellen sowie AU reichen destabilisierende Elemente, die die Stabilität der Abschrift beeinträchtigen können.

Introduction

Die Bildung von 3′-Ende ist ein entscheidender Schritt in mRNA-Reifung, die besteht aus der Spaltung der Pre-mRNA flussabwärts ein Pas, gefolgt von dem Zusatz von ~ 250 Untemplated Adenines, die Poly Tail^1,2ausmachen. Poly-Bindeprotein (PABP) bindet an das Poly-Heck, und das schützt die mRNA-Transkript vor Abbau und erleichtert die Übersetzung¹.

Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass 70 % der menschlichen Gene mehrere PASs haben und somit alternative Polyadenylation, wodurch mehrere 3′ Enden³zu unterziehen. So ist es wichtig zu erkennen, wo die Poly-Rute für den Rest der 3′ UTR legt, sowie identifizieren die PAS von jeder gegebenen Protokoll verwendet. Das Aufkommen der Sequenzierung der nächsten Generation führte die gleichzeitige Identifikation von 3′ wo und den PASs von tausend Genen. Dieser Anstieg der Sequenzierung Fähigkeit erforderte die Entwicklung von der bioinformatische Algorithmen für die Datenanalyse mit alternative Polyadenylation vom 3′-Ende. Für die de-Novo -Erkennung oder Validierung des PAS und damit des 3′ Endes einzelner Gene von großflächigen Sequenzierungsdaten mapping bleibt 3′ Rennen die Methode der Wahl^4,5. Die Sequenzen in cDNA-Produkte von 3′ Rennen enthalten normalerweise enthalten nur einen Teil der 3′ UTR, die Poly-Tail, die Spaltstelle, PAS und die Sequenzen stromaufwärts des PAS enthält. Im Gegensatz zu PCR, wonach die Gestaltung und Nutzung von Gen spezifische forward und reverse Primer benötigt 3′ Rennen nur zwei Gen spezifische verschachtelte forward Primer. PCR erfordert daher eine genauere Kenntnis der Nukleotidsequenz einer großen Region des Gens wird verstärkt^4,6. Da 3′ Rennen verwendet umgekehrt das gleiche Grundierung, dass Ziele der poly(A) tail für alle Polyadenylated RNA-Transkripte, nur die forward Primer gen spezifische, müssen somit nur erfordern Kenntnisse über eine deutlich kleinere Region der mRNA. Dies ermöglicht die Verstärkung der Regionen, deren Sequenzen nicht vollständig charakterisiert^4,7. Dadurch konnten 3′ Rennen verwendet werden, nicht nur um festzustellen, das 3′-Ende eines Gens, sondern um auch zu bestimmen und zu charakterisieren, große Regionen oberhalb des PAS, die einen erheblichen Teil der 3′ UTR bilden. Durch die Kombination von 5′ Rennen mit der modifizierten 3′ Rennen, die größere Teile der 3′ UTR und flankierenden Regionen umfasst, ist es möglich, vollständig sequenzieren oder Klonen eine gesamte mRNA-Transkript von 5′-Ende, deren Ende 3′⁸.

Ein Beispiel für die Anwendung der geänderten 3′ RACE ist die jüngste Identifizierung eines Romans CCND1-MRCK Fusion gen Abschrift von Mantel-Zell-Lymphom-Zell-Linien und Krebspatienten. Die 3′ UTR bestand aus Sequenzen aus der CCND1 und MRCK Gene und widerspenstigen MiRNA Verordnung⁹war. Die zwei verschachtelte CCND1 spezifische vorwärts Primer wurden ergänzend zu der Region unmittelbar neben und hinter der CCND1 -Stopp-Codon. Obwohl ganze Transkriptom Sequenzierung zusammen mit spezifischen Bioinformatic Hilfsmittel verwendet werden kann, um gen Fusionen innerhalb der 3′ UTR-¹⁰zu erkennen, können viele Labore fehlen die finanziellen Mittel oder Bioinformatic Know-how, um diese Technologie nutzen. Daher ist 3′ Rennen eine Alternative zur de-Novo -Identifizierung und Validierung von Roman Fusionsgene mit der 3′ UTR. In Anbetracht der drastische Anstieg der Zahl der gemeldeten Fusionsgene sowie die Transkripte durchlesen, 3′ Rennen ein mächtiges Werkzeug bei der Charakterisierung von Gen-Sequenzen^11,12geworden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese verschiedenen Sequenzen innerhalb der 3′ UTR sowie die Länge der 3′ UTR mRNA-Transkript Stabilität, Lokalisierung, Übersetzbarkeit und Funktion¹³beeinflussen kann. Zum Teil auf ein verstärktes Interesse bei der Zuordnung des Transkriptoms, gab es eine Zunahme der Anzahl der verschiedenen DNA-Polymerasen für den Einsatz im Labor entwickelt. Es ist wichtig, festzustellen, was Arten von Änderungen an die 3′ Rennen Protokoll in bestellen, nutzen Sie die verfügbaren Repertoire von DNA-Polymerasen erfolgen können.

Diese Arbeit Berichte Anpassung 3′ Rennen die gesamte 3′ UTR zuordnen, die PAS und die 3′ Ende Spaltstelle der ANKHD1 Abschrift mit Primer im Abschnitt ANKHD1 die Abschrift und zwei verschiedene DNA-Polymerasen verschachtelt.

Protocol

Jederzeit während der Durchführung aller Verfahren in diesem Protokoll tragen Sie ein Kittel, Handschuhe und Schutzbrille. Sicherstellen Sie, dass Container/Röhrchen mit Phenol und Guanidin Reagenz erfolgt nur in einem zertifizierten Haube und Phenol Abfälle in einem dafür vorgesehenen Behälter entsorgen geöffnet werden. DNAse/RNAse-freie sterilen Röhrchen, Tipps und Reagenzien zu verwenden. (1) Zellkultur Wachsen die HeLa-Zelllinie und zwei Aussetzung Mantel Zelle Lymphom Ze…

Representative Results

Verschachtelte Forward Primer suchen: Das Agarosegel von Abbildung 1 zeigt zwei unterschiedliche PCR-Gelprodukte (Bahnen 1 und 2), welche das gleiche Grundierung aber verschiedene reverse Primer weiterleiten. Bahn 3 hat ein eindeutig identifizierbares PCR-Produkt und hat eine ausgeprägte vorwärts- und Grundierung. Die ideale Primer für die PCR-basierten Reaktion zu verwenden sind di…

Discussion

Trotz des Aufkommens der massiven parallelen Sequenziertechnologien auf Basis gen von gen bleibt 3′ Rennen immer noch die einfachste und wirtschaftlichste Methode zur Identifizierung der PAS und Nukleotide angrenzend an das Poly-Heck. Die hier beschriebene Anpassung erweitert mit 3′ Rennen sowohl verstärken als auch Karte Sequenzen, die einen Teil des ORF, das Stopp-Codon und die gesamte 3′ UTR der ANKHD1 mRNA Abschrift enthalten. Ein großer Vorteil von 3′ RACE ist, dass Produkte von 3′ Rennen mit ein paar kle…

Materials

HeLa cells	ATCC	CCL-2	Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells	ATCC	CRL-3006	Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells	DSMZ	ACC-342	Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	F6178	Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisherScientific	15140122	Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue	Ambion	AM9545	Coprecipitant.
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution	Corning	21-030	1X PBS.
Chloroform	Sigma  Aldrich	C7559-5VL
2-propanol	Sigma Aldrich	I9516
Reagent Alcohol	Sigma Aldrich	793175	Ethanol
Ethidium Bromide solution	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol Reagent	ThermoFisherScientific	15596026	Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix	Amresco	N867	2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 RNase-Free DNase	Promega	M6101	Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase	Agilent Technologies	600670	Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fischer	K1691	Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder	5 Prime	2500360	Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder	New England BioLabs	N3233L	Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer	MidSci	VM-3200
Mini Centrifuge	MidSci	C1008-R
Dry Bath	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System	BioRad	1704469	Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050	Power supply for gel electrophoresis.
Agarose	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler Gradient	Eppendorf	950000015	PCR thermocycler.
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Centrifuge	Eppendorf	5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System	Promega	A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire	MidSci	MY-PCR24	Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood	ThermoFisherScientific		Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter	Beckman Coulter	6605698	Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0	Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)		Software to analyze Sanger sequencing data.