Summary

Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

Published: March 28, 2018
doi:

Summary

La dos diferentes 3′ amplificación rápida del cDNA extremos (3′ RACE) protocolos descrito aquí hacen uso de dos diferentes polimerasas de la DNA para asignar las secuencias que incluyen un segmento del marco de lectura abierto (ORF), el codón de parada y el entero 3′ UTR de una transcripción utilizando RNA obtenidos de líneas celulares de cáncer diferentes.

Abstract

Maduración de los mRNAs eucarióticos consiste en 3′ final de formación, que consiste en la adición de una cola de poly(A). Para asignar el extremo 3′ de un gen, el método tradicional de elección es 3′ amplificación rápida del cDNA extremos (3′ RACE). Protocolos para 3′ raza requieren el cuidado diseño y selección de primers anidados dentro de la región 3′ no traducida (3′ UTR) del gen Diana de interés. Sin embargo, con algunas modificaciones, el protocolo puede utilizarse para incluir el entero 3′ UTR y secuencias dentro del marco de lectura abierto (ORF), proporcionando una visión más comprensiva de la relación entre el ORF y el 3′ UTR. Se trata además de identificación de la señal de poliadenilación (PAS), así como el escote y poliadenilación sitio provisto por convencional 3′ RACE. Ampliado 3′ RACE puede detectar inusual 3′ UTRs, incluyendo fusiones de genes dentro de los 3′ UTR, y la información de secuencia puede utilizarse para predecir potenciales sitios de unión de miRNA como AU rica desestabilizar elementos que puedan afectar la estabilidad de la transcripción.

Introduction

La formación del extremo 3′ es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción1.

Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3′ extremos3. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3′ UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3′ UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3′. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3′ de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3′ carrera sigue siendo el método de elección4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3′ raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3′ UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3′ RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado4,6. 3′ carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas4,7. Esto ha permitido 3′ carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3′ de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3′ UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3′ carrera que incluye grandes porciones de 3′ UTR y regiones flanqueantes 5′, es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5′ a sus 3′ extremo8.

Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3′ RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3′ UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento9. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3′ UTR10, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3′ RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3′ UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3′ RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3′ UTR como la longitud de los 3′ UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función13. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3′ protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.

Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3′ UTR 3′, el PAS y el 3′ final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.

Protocol

Usar una bata de laboratorio, guantes y gafas de seguridad en todo momento mientras se realizan todos los procedimientos en el presente Protocolo. Asegúrese de que envases y tubos que contienen el reactivo de fenol y guanidina isotiocianato sólo se abren en una capilla certificada y disponer de los residuos de fenol en un contenedor designado. Utilizar reactivos, puntas y tubos estériles libre de DNasa/Rnasa. 1. cultivo celular Crecer la línea celular HeLa y dos suspensión manto…

Representative Results

Búsqueda anidada Primer avance: El gel de agarosa de La figura 1 muestra dos distintas gel productos de la PCR (carriles 1 y 2) que utilizan la misma adelante cartilla pero diferentes primers inversas. Carril 3 tiene un producto PCR distinto y distinto primer avance y retroceso. Los iniciadores ideal a utilizar para la reacción de PCR basado en son los que dan un producto PCR diferen…

Discussion

A pesar del advenimiento de las tecnologías de secuenciación masiva en paralelo, sobre una base de gen por gen, 3′ carrera sigue siendo el método más fácil y más económico para identificar la PAS y nucleótidos adyacentes a la cola de poly(A). La adaptación descrita aquí expande utilizando 3′ carrera a amplificar tanto mapa secuencias que incluyen una porción del ORF, el codón de parada y el entero 3′ UTR de la transcripción del mRNA de ANKHD1 . Una ventaja de 3′ RACE es que con algunas adaptaciones …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría reconocer a Bettine Gibbs por su ayuda técnica.

Materials

HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Play Video

Cite This Article
Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3′ Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

View Video