Base di un semplice flusso Cytometry Assay per determinare In Vitro dell'anticorpo dipendente valorizzazione del Virus di febbre rompiossa utilizzando siero convalescente Zika Virus
Summary
Descriviamo un protocollo semplice e facile per misurare il miglioramento dipendente dell’anticorpo dell’infezione di siero convalescente di Zika virus utilizzando le particelle virali di Reporter di virus della Dengue.
Abstract
Il potenziamento dipendente dell’anticorpo dell’infezione ha dimostrato di giocare un ruolo importante nella patogenesi virale Dengue. Tradizionale analisi che misurano la capacità di anticorpi o siero per migliorare infezione nelle linee cellulari impermissible hanno fatto affidamento sull’utilizzo uscita virale nei media seguiti da saggi di placca per quantificare l’infezione. Più recentemente, queste analisi hanno esaminato l’infezione di febbre rompiossa virus (DENV) nelle linee cellulari usando gli anticorpi fluorescente contrassegnati. Entrambi questi approcci presentano limitazioni che limitano l’uso molto diffuso di queste tecniche. Qui, descriviamo un’analisi semplice in vitro usando Dengue virus reporter particelle virali (RVP) che esprimono la proteina fluorescente verde e le cellule K562 per esaminare potenziamento dipendente dell’anticorpo (ADE) dell’infezione di DENV usando il siero che è stato ottenuto da rhesus macachi 16 settimane dopo l’infezione con il virus di Zika (ZIKV). Questa tecnica è affidabile, comporta la minima manipolazione delle cellule, non implicano l’uso di virus competente replica dal vivo e può essere eseguita in un formato di throughput elevato per ottenere una lettura quantitativa mediante citometria a flusso. Inoltre, questo test può essere facilmente adattato per esaminare aumento dipendente dell’anticorpo (ADE) di altre infezioni da flavivirus come il virus della febbre gialla (YFV), virus dell’encefalite equina giapponese (JEEV), virus del Nilo occidentale (WNV) ecc dove RVP sono disponibili. La facilità di configurazione di test, analisi dei dati e interpretazione dei risultati rende altamente favorevole alla maggior parte delle impostazioni di laboratorio.
Introduction
Anticorpo dipendente miglioramento (ADE) dell’infezione è un processo per cui le risposte parzialmente traversa-reattivo anticorpo indotte da un sierotipo del virus migliora l’assorbimento di un altro sierotipo del virus, che conduce la viremia e replicazione virale aumentata. ADE è stato ampiamente documentato nelle infezioni di Dengue virus (DENV) dove quattro principali sierotipi sono prevalenti. In un sottogruppo di pazienti, ADE è associata con febbre emorragica Dengue (DHF). Abbiamo recentemente dimostrato che l’infezione del virus (ZIKV) di Zika indotto significativamente elevati livelli di risposte di anticorpi cross-reattivi DENV causato ADE di DENV in vitro , che probabilmente ha contribuito alla valorizzazione di DENV viremia in vivo1 , 2. analisi dell’anticorpo dipendente di potenziamento sono uno strumento prezioso per valutare la capacità degli anticorpi per migliorare secondario infezione con virus collegati e offrire preziose comprensioni nella patogenesi delle infezioni da flavivirus e informare il sviluppo di vaccini.
Il test descritto qui usa DENV RVP insieme con le cellule K562 che sono normalmente inammissibile all’infezione. RVP sono strutturalmente intatto replica incompetente DENV particelle virali che codificano un replicone sub-genomica della proteina fluorescente verde (GFP) che è espresso dopo un singolo ciclo di replica3. Come tale, le cellule che infettano con RVP reagiscono in verde e possono essere facilmente individuate mediante citometria a flusso o microscopia. La RVP usato per questo test sono stati ottenuti da fonti commerciali. Tuttavia, possono essere generati contro altri virus e usato per il test descritto in questo manoscritto. Nel frattempo, le cellule K562 sono un’espressione FcγIII-linea cellulare di leucemia che si legano alla regione Fc degli anticorpi e infettarsi in presenza di Sub-neutralizzare le concentrazioni di anticorpi4,5.
Saggi di ADE sono stati ampiamente utilizzati negli studi che studiano i fattori di rischio per grave dengue e di delineare i meccanismi di in vitro ADE6,7,8. Il dosaggio di ADE descritto qui può essere rapidamente e facilmente utilizzato per determinare la capacità del siero per migliorare l’infezione in vitro utilizzando RVP e flusso cytometry, rispetto ad altri dosaggi utilizzati attualmente, che richiedono sia la determinazione della placca formando unità (pfu) in cellule Vero o macchiatura dell’anticorpo di infetti cellule6,7,8,9,10,11, entrambi i quali sono in termini di tempo e manodopera intensivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flavivirus come DENV e ZIKV condividere testimonianze significative di omologia in entrambe le loro proteine strutturali e non strutturali che generano gli anticorpi che cross-reagiscono con a vicenda13,14. Queste risposte di anticorpi cross-reattivi sono state indicate per migliorare di infezione sia in vivo che in vitro con un sierotipo eterologo o altro relativi flavivirus1,2. Il pote…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto descritto è stato sostenuto dalla Uniformed Services University Health Sciences a JJM. Le opinioni o le affermazioni contenute nel presente documento sono quelle private degli autori e non sono per essere interpretato come ufficiale o riflettenti le viste del dipartimento della difesa, la Uniformed Services University Health Sciences o qualsiasi altra agenzia degli Stati Uniti Governo.
WGV eseguito tutti gli esperimenti e analizzato i dati; JJM progettato e supervisionato lo studio; WGW e JJM ha scritto il libro.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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