Простой проточной цитометрии на основе анализа для определения в Vitro антитела зависит повышение вируса денге, с помощью вируса Зика выздоравливающих сыворотки
Summary
Мы опишем простой и простой протокол для измерения антитела зависит повышение инфекции от Зика выздоравливающих сыворотки вирус с помощью вируса денге репортер вирусных частиц.
Abstract
Было показано, что антитела зависит от укрепления инфекции играют важную роль в патогенезе вирусной лихорадки денге. Традиционные анализы, которые измеряют антител или сыворотки способность повышения инфекции в недопустимых клеточных линий полагались на использование вирусных вывода в СМИ, следуют налета анализов для количественного определения инфекции. Совсем недавно эти анализы изучили денге вируса (DENV) в клеточных линий, с помощью дневно обозначенные антитела. Оба эти подхода имеют ограничения, которые ограничивают широкое использование этих методов. Здесь мы опишем простой в vitro пробирного с помощью денге репортер вирусные частицы вируса (РВП) которые выражают Зеленый флуоресцирующий белок и клетках K562 для изучения антитела зависит от повышения (ADE) DENV-инфекции с использованием сыворотки, которая была получена от резус макак 16 недель после инфицирования вирусом Зика (ZIKV). Эта техника является надежным, предполагает минимальный манипуляции клеток, не связаны с использованием живой репликации вируса и компетентных и может быть выполнена в формате высокой пропускной способности, чтобы получить количественные индикации с помощью проточной цитометрии. Кроме того этот assay может быть легко адаптирована для изучения антитела зависит от расширения (ADE) других flavivirus инфекций, таких как вирус желтой лихорадки (YFV), вирус японского энцефалита лошадей (ДЖИВ), вирус Западного Нила (ВЗН) и т.д., где имеются РВП. Простота настройки анализа, анализа данных и интерпретации результатов делает его очень поддаются большинство лабораторных параметров.
Introduction
Антитела зависит от расширения (ADE) инфекции — это процесс, согласно которому частично cross-reactive антитела реакций, вызванных серотипа вируса повышает усвоение другого серотипа вируса, приводит к увеличению вирусной репликации и виремии. Аде был хорошо документированы в инфекции вируса (DENV) денге, где распространены четыре основных серотипов. В подгруппе пациентов Аде связан с геморрагической лихорадки денге (ГЛД). Недавно мы показали, что инфекции вируса (ZIKV) Зика индуцированной значительно высокий уровень DENV cross-reactive антитела ответов, которые вызвали Аде DENV в пробирке и вероятно, способствовали укреплению DENV виремии в естественных условиях1 , 2. антитела зависит улучшение анализов являются ценным инструментом для оценки способности антител для повышения вторичной инфекции, связанной с вирусами и предоставлять ценную информацию в патогенезе flavivirus инфекций и информировать разработка вакцин.
Assay описанные здесь использует DENV РВП наряду с K562 клетки, которые обычно неприемлемы для инфекции. РВП являются структурно нетронутыми репликации некомпетентных DENV вирусных частиц которые кодируют репликоном суб геномных Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), которая выражается после одного раунда репликации3. Таким образом клетки, которые инфицируются РВП флуоресцировать Грин и могут быть легко обнаружены с помощью проточной цитометрии или микроскопии. РВП, используемые в этот assay были получены из коммерческих источников. Они могут однако, быть против других вирусов и используется в assay, описанные в этой рукописи. Тем временем K562 клетки являются FcγIII рецепторов выражая лейкемии клеток линии, привязка к региону Fc антител и заразиться присутствии югу нейтрализации концентрации антител в4,5.
Аде анализы широко использовались в исследования, изучения факторов риска для тяжелой денге и определить механизмы в vitro Аде6,,78. Assay Аде, описанные здесь можно быстро и легко использоваться для определения способности сыворотки для повышения в vitro инфекции с помощью РВП и проточная цитометрия, по сравнению с другими анализов, используемых в настоящее время, которые требуют либо определения формирования зубного налета единицы (ОРП) в клетках Vero или антитело пятная из инфицированных клеток6,,78,9,10,11, оба из которых являются много времени и труда интенсивный.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flaviviruses как DENV и ZIKV поделиться существенные доказательства гомологию в обоих их структурных и неструктурных белки, которые генерируют антитела, которые cross-react друг с другом13,14. Было показано, что эти ответы cross-reactive антитела расширения инфекции как в ест…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Описан проект был поддержан средств от Uniformed услуги университета медицинских наук JJM. Мнения или утверждения, содержащиеся в настоящем документе являются частные авторов и не быть истолковано как официальный или отражающих мнения Министерства обороны, Uniformed услуги университета медицинских наук или любым другим учреждением, США Правительство.
WGV все эксперименты и анализ данных; JJM разработал и руководил исследования; РГК и JJM написал бумагу.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
- George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
- Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
- Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
- Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via, ., F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
- Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
- Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
- Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
- Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
- Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
- Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
- Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
- Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
- Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
- Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).
