A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika
Summary
Descreveremos um protocolo simples e fácil para medição de reforço dependente de anticorpo da infecção por Zika vírus soro convalescente usando partículas virais da Dengue vírus repórter.
Abstract
Realce dependente de anticorpo da infecção foi mostrado para jogar um papel importante na patogênese viral de Dengue. Os ensaios tradicionais que medem a capacidade dos anticorpos ou soro para aumentar a infecção em linhas celulares impermissible têm invocado usando saída viral na mídia seguida de ensaios de placa para quantificar a infecção. Mais recentemente, estes ensaios examinaram a infecção por vírus (DENV) Dengue em linhas celulares usando anticorpos fluorescente etiquetados. Ambas as abordagens têm limitações que restringem o uso generalizado destas técnicas. Aqui, descrevemos um ensaio simples em vitro usando Dengue vírus repórter partículas virais (RVPs) que expressam a proteína verde fluorescente e células K562 para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de infecção DENV usando soro que foi obtido a partir do rhesus macacos de 16 semanas após a infecção com vírus Zika (ZIKV). Esta técnica é confiável, envolve manipulação mínima das células, não envolve a utilização de vírus competente de replicação ao vivo e pode ser executada em um formato de alta taxa de transferência para obter uma leitura quantitativa usando citometria de fluxo. Além disso, este ensaio pode ser facilmente adaptado para examinar o anticorpo dependente do realce (ADE) de outros flavivirus infecções tais como o vírus da febre amarela (YFV), vírus da encefalite equina japonesa (LILICA), vírus do Nilo Ocidental (WNV) etc onde RVPs estão disponíveis. A facilidade de criação de ensaio, analisando os dados e interpretação de resultados tornam altamente receptivos a maioria das configurações de laboratório.
Introduction
Reforço de dependente de anticorpos (ADE) da infecção é um processo pelo qual respostas parcialmente cross-reactive anticorpos induzidas por um sorotipo de vírus aumenta a absorção de outro sorotipo do vírus, levando a virémia e aumento de replicação viral. ADE tem sido extensivamente documentada em infecções por vírus (DENV) Dengue onde quatro sorotipos principais são predominantes. Em um subconjunto de pacientes, ADE está associada com febre hemorrágica da Dengue (FHD). Recentemente mostramos que infecção por vírus (ZIKV) Zika induzido níveis significativamente elevados de respostas de anticorpos cross-reactive DENV que causou ADE de DENV em vitro e provavelmente contribuíram para o reforço da virémia no vivoDENV1 , 2. ensaios de realce dependente de anticorpo são uma ferramenta valiosa para avaliar a capacidade dos anticorpos para melhorar a infecção secundária com vírus relacionados e fornecer insights valiosos sobre a patogênese das infecções flavivirus e informar o desenvolvimento de vacinas.
O ensaio descrito aqui usa DENV RVPs juntamente com células K562 que são normalmente inadmissíveis à infecção. RVPs são estruturalmente intacta replicação incompetente DENV partículas virais que codificar um Replicão subgenômica de proteína verde fluorescente (GFP) que manifesta-se após uma única rodada de replicação3. Como tal, as células que são infectadas com RVPs fluorescem verde e podem ser facilmente detectadas usando citometria de fluxo ou microscopia. Os RVPs usadas neste ensaio foram obtidas de fontes comerciais. Eles podem, no entanto, ser gerado contra outros vírus e utilizada no ensaio descrito neste manuscrito. Enquanto isso, as células K562 são uma linhagem de células de leucemia FcγIII-receptor-expressando que se ligam à região Fc dos anticorpos e tornar-se infectado na presença de sub, neutralizando as concentrações de anticorpos4,5.
ADE ensaios têm sido amplamente utilizados em estudos investigando os fatores de risco para dengue grave e para delinear os mecanismos em vitro ADE6,7,8. O ensaio de ADE descrito aqui pode ser rapidamente e facilmente usado para determinar a capacidade do soro para aumentar a infecção em vitro usando RVPs e fluxo cytometry, em comparação com outros ensaios utilizados atualmente, que também exigem a determinação da formação de placa bacteriana unidades (pfu) em células Vero ou mancha do anticorpo de infectados células6,7,8,9,10,11, ambos os quais são demorados e trabalhistas intensiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flavivírus como DENV e ZIKV compartilham significativa evidência de homologia em ambas as suas proteínas estruturais e não estruturais que geram anticorpos que reagem de forma cruzada com os outros13,14. Estas respostas de anticorpos cross-reactive têm sido mostradas para melhorar da infecção in vivo e em vitro com um sorotipo heterólogo ou outros relacionados flavivírus1,2. O p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto descrito foi apoiado por fundos da Universidade de Ciências da saúde serviços fardado a JJM. As opiniões ou declarações contidas neste documento são os privados dos autores e não são ser interpretado como oficiais ou refletindo as opiniões do departamento de defesa, a Universidade de serviços fardado de Ciências da saúde ou qualquer outra agência dos Estados Unidos Governo.
WGV executadas todas as experiências e analisa os dados; JJM projetou e supervisionou o estudo; WGW e JJM escreveram o jornal.
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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