単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法
Summary
デング熱ウイルス記者ウイルス粒子を用いたジカ ウイルス回復期血清による抗体依存による感染症を測定するためのシンプルで簡単なプロトコルについて述べる。
Abstract
感染症の抗体依存強化は、デング熱ウイルスの病因の主要な役割を果たすことに示されています。許容されない細胞の感染を強化する抗体や血清の容量を測定する伝統的なアッセイは、感染を定量化するプラクの試金に続いてメディアにウイルスの出力を使用してに頼ってきました。最近では、これらの試金は細胞を蛍光標識抗体を用いたデング ウイルス (DENV) 感染症を検討しています。これらの両方のアプローチには、これらの技術の広範な使用を制限する制限があります。ここでは、粒子を用いたデング ウイルス記者ウイルス (RVPs) 緑色蛍光蛋白質及び DENV 感染アカゲザルから得られた血清を用いた抗体依存強化 (ADE) を調べる K562 細胞を表す単純の in vitroアッセイについて述べるニホンザル ジカ (ZIKV) 感染後 16 週間。この手法は信頼性が高く、セルの最小の操作が含まれます、ライブ レプリケーション有能なウイルスの使用を含まない、フローサイトメトリーを用いた定量的な読み出しを取得する高スループット形式で実行することができます。さらに、このアッセイは、黄熱病ウイルス (YFV) 日本脳炎ウイルス (JEEV)、西ナイル ウイルス (WNV) など RVPs の利用など他のフラビ ウイルス感染症の抗体依存強化 (ADE) を調べる簡単に適合できます。アッセイのセットアップのしやすさ、データを分析し、結果の解釈になりますほとんどの実験室の設定に
Introduction
感染症の抗体依存強化 (ADE) は、ウイルスの血清型による部分的に交差反応性抗体がウイルス、高められたウイルスの複製とウイルス血症につながる他の血清型の取り込みを強化するというプロセスです。ADE は、広く 4 つの主要な血清型が流行しているデング熱ウイルス (DENV) 感染症に記載されています。患者のサブセット、ADE はデング出血熱 (DHF) に関連付けられています。ジカ ウイルス (ZIKV) の感染誘導 DENV ADE体外を引き起こし、DENV生体内でウイルス血症1の強化に貢献した DENV 交差反応性抗体の有意に高い値であることが最近分かった,2抗体依存強化試金、関連ウイルスの二次感染を強化とフラビ ウイルス感染症の発症機序に貴重な洞察力を提供し、通知に対する抗体の能力を評価する貴重なツール、。ワクチンの開発。
説明アッセイは、ここが感染症に通常許容 K562 細胞と一緒に DENV RVPs を使用します。RVPs が構造的にそのまま複製無能 DENV ウイルス粒子レプリケーション3の単一のラウンドの後に表示されるサブ ゲノム緑色蛍光タンパク質 (GFP) レプリコンをエンコードします。など、RVPs に感染している細胞は緑色の蛍光を発する、フローサイトメトリーや顕微鏡を使用して容易に検出することができます。この試金で使用される RVPs は、商業ソースから得られました。あってもいい、しかし、他のウイルスに対して生成され、本稿に記載されている試金で使用されます。一方、K562 細胞、抗体の Fc 領域に結合し、サブ中和抗体4、5の濃度の存在下で感染 FcγIII 受容体発現の白血病細胞株であります。
ADE の試金は体外ADE のメカニズムを記述する重症のデング熱の危険因子を調査し、研究で広く使用されている6,7,8。ここで説明した ADE アッセイ迅速かつ簡単に使える RVPs を使用して生体外で感染を強化し、フローサイトメトリー、現在、使用していずれかを必要とする他の試金と比較してプラーク形成による血清の容量を決定するにはVero 細胞や抗体の汚損の単位 (pfu) 感染細胞6,7,8,9,10、11、どちらも時間がかかり、労働集中的です。
Protocol
Representative Results
Discussion
DENV や ZIKV などの発現は、両方の構造および非構造タンパク質13,14お互いと交差反応する抗体を生成する相同性の重要な証拠を共有します。これらの交差反応性抗体応答を高めるために示されている感染症の両方との in vitro異種血清または他関連発現1,2。クロスの感染を高める可能性のある?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
記載されているプロジェクトは、JJM に健康科学の制服サービス大学からの資金によって支えられました。著者のプライベートなものは、意見またはアサーション記載する解釈として公式または反射防衛省、健康科学の制服サービス大学や米国の他の機関の見解ではないです。政府は。
WGV すべての実験を行いデータを分析JJM 設計し、試験を監督ニシコククジラ、JJM 紙を書いた。
Materials
| DENV 1-4 RVP | Integral Molecular | RVP-501 | |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| RPMI | Corning | 10-040-CV | |
| FBS | GE lifesceinces | SH 30910.03 | 10% FBS in RPMI-10 |
| Penicillin-Streptomycin | MP biomedicals | 1670049 | 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10 |
| HEPES | Cellegro | 25-060-Cl | 0.025M in RPMI-10 |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) | Sigma | M7145 | 1x in RPMI-10 |
| Sodium Pyruvate | Cellegro | 25-000-Cl | 1mM in RPMI-10 |
| L-glutamine | Fisher Scientific | MT25005CI | |
| Sterile V-bottom plates | Thomas Scientific | 333-8001-01V | |
| BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes | VWR | 60819-728 | |
| Non-sterile U-bottom plates | Falcon | Ref 353910 | A high throughput alternative to FACS tubes |
| 5mL, sterile, serological pipette | Denville | P7127 | |
| 200uL sterile pipette tips | Denville | P3020 CPS | |
| 20uL sterile pipette tips | Denville | P1121 | |
| 50-200uL multichannel pipette | Denville | P3975-8-B | |
| 5-50uL multichannel pipette | Denville | P3975-9-B | |
| 20% formadehyde | Tousimis | #1008B | |
| Water Bath | ThermoFisher | TSCOL35 | |
| thermomixer | Eppendorf | 2231000387 | An alternative to a waterbath for heat inactivation |
| CO2 Incubator | ThermoFisher | 13-998-213 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 | |
| Flowjo 9.8 | TreeStar, Inc. | Flow cytometry analysis software | |
| BD FACSDiva 6.1.2 | Becton Dikinson | ||
| BD LSR II flow cytometer | Becton Dikinson | ||
| Liquid Bleach | Fisher Scientific | NC9724348 |
References
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