Høj-følsomhed påvisning af Micrometastases genereret af normal god landbrugspraksis Lentivirus-transduced Organoids kulturperler fra en Patient-afledte tyktarmen tumoren
Summary
For at tillade meget følsomme påvisning af den udbrede menneskelige kolorektal cancer (CRC) celler koloniserer væv, viser vi heri en protokol for effektiv transduktion af grøn fluorescerende proteiner (NGL) lentiviral partikler i PDX-afledte CRC organoid celler forud for deres injektion i modtagerens mus, med stereo-fluorescens mikroskopiske observation.
Abstract
Trods aktuelle fremskridt i menneskelige kolorektal cancer (CRC) behandling er få radikale behandlinger effektive til de sene stadier af CRC. At overvinde denne klinisk udfordring, tumor xenograft musemodeller ved hjælp af veletablerede menneskeligt carcinom cellelinjer og mange Transgene mus er blevet udviklet modeller med tumorer som prækliniske modeller. De efterligne delvis funktioner af menneskelige karcinomer, men ofte undlader at sammenfatte de vigtigste aspekter af menneskelig maligniteter herunder invasion og metastaser. Alternative modeller, at bedre repræsenterer den maligne progression i menneskelige CRC har således længe ventet.
Heri viser vi generation af patient-afledte tumor xenografts (PDXs) af subkutane implantation af små CRC fragmenter kirurgisk dissekeret fra en patient. Tyktarmen PDXs udvikle og histopathologically ligner CRC i patienten. Par spontane micrometastases er imidlertid påvises i konventionelle tværsnit af berørte fjerntliggende organer i PDX-modellen. For at lette påvisning af metastatisk spredning til fjerntliggende organer, vi udtrukket organoid tumorceller fra kolon PDXs i kultur og inficeret dem med normal god landbrugspraksis lentivirus før injektion i stærkt immundefekte NOD/Shi-scid IL2Rγnull (NOG) mus. Orthotopically indsprøjtet PDX-afledte CRC organoid celler konsekvent form primære tumorer positive for normal god landbrugspraksis i modtagerens mus. Desuden, at spontant udvikle micrometastatic kolonier udtryk for normal god landbrugspraksis er især fundet i lungerne af disse mus af Fluorescens mikroskopi. Derudover producerer intrasplenic injektion af CRC organoids ofte hepatisk kolonisering. Taget sammen, viser disse resultater normal god landbrugspraksis-mærket PDX-afledte CRC organoid celler til at være visuelt kan påvises under en omstændelig proces betegnes invasion-metastase cascade. De beskrevne protokoller omfatter etablering af PDXs af menneskelige CRC og 3D kultur af de tilsvarende CRC organoid celler transduced af normal god landbrugspraksis lentiviral partikler.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft dødsfald på verdensplan1. De utilstrækkelige svar på konventionel behandling af patienter med fremskreden sygdom angiver ineffektive forsøg på at radikalt helbrede CRCs. For at udvikle mere effektive terapeutiske metoder, der er oprettet forskellige prækliniske musemodeller af kræft, der efterligner Karakteristik af CRCs. Forskellige CRC cellelinjer har været meget anvendt til at generere tumor xenografts på grund af deres bekvemmelighed og lethed af manipulation. Langsigtet kultur af kræft cellelinjer, dog forårsager ofte udvalg af unikke cellepopulationer, der er ganske proliferativ under en bestemt kultur tilstand, hvilket resulterer i upålidelige resultater og afgørende begrænsninger i prækliniske stof udvikling.
Uden at være kultiveret in vitro-, har patient-afledte tumor xenografts (PDXs) også været genereret af implantation i dyremodeller for humane CRC væv kirurgisk dissekeret fra patienter2,3,4. PDXs er bredt anerkendt som recapitulating histopatologiske hovedtræk og genetiske ændringer oprindelig præsentere i tumorer af de patienter, som de er fremstillet. Derudover sammensat patient-afledte tumor organoids af tumor celle klynger blev etableret af kultur 3D betingelser, der nøje efterlignede de biologiske egenskaber af den oprindelige tumorer5,6. Disse tumor organoids blev også anvendt til høj overførselshastighed stof screening, hvilket giver mulighed for personlig behandlinger til at være designet5. Dog markant heterogene CRC populationer antages for at være til stede i en tumor masse. Særlig CRC befolkninger kan selektivt formere og udvide under in vivo og in vitro- serien af passager af PDX og tumor organoids, henholdsvis. Dette kan også give samlede gen expression profiler og epi/genetiske status for den berørte CRCs at ændre, hvilket resulterer i minimalt ligner forældrenes CRC.
Patient-afledte CRC organoids og dem udvundet fra noncancerous menneskelige kolon manipuleret til havn kombinationer af muterede mutationer har også været ansat til at undersøge kendetegnende for humane tumorceller eksemplificeret ved tumor invasion og metastase 6,7,8,9. Men den meget lav forekomst af spontan metastase udspringer orthotopic implantation af patient-afledte CRC til immundefekte mus, har gjort det vanskeligt at studere de omstændelig proces af invasion-metastase kaskade, der omfatter lokale invasion, intravasation, transport i blodbanen, ekstravasation og kolonisering af fjerntliggende organer4,10. Micrometastasis som repræsenteret ved tumor celle aflejring af ≤2 mm, dannet af patient-afledte CRC organoids, er ofte blevet overset på histopatologiske analyse af sektioner fra berørte fjerntliggende organer i eksperimentel musemodeller. Visualisering af spontan micrometastases har også været minimal i vivo på grund af vanskeligheden ved effektivt at indføre fluorescerende markører i tumorceller organoid før deres injektion i modtagerens mus. I denne undersøgelse, udviklede vi en protokol til effektivt transduce normal god landbrugspraksis lentivirus i PDX-afledte CRC organoid celler i 3D kultur før injektion til recipient mus og at tillade meget følsomme påvisning, beskæftiger stereo-Fluorescens mikroskopi, af deres kolonisering af forskellige organer til form micrometastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selvom CRC PDX model har været bredt ansat til at studere primær tumorvækst, om denne model er også relevant at undersøge tumor metastaser har ikke endnu blevet fuldt belyst. Spontan metastaser var også knap påviselig i leveren og lungerne af forskellige rapporterede kolon PDX modeller4,10. For at registrere micrometastases med høj følsomhed, udviklede vi en protokol til transducing normal god landbrugspraksis lentiviral partikler i PDX-afledte CRC organ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det Juntendo Universitet Young Investigator Award (2013, 2014 og 2015) år gammel, det fælles projekt Award (2013 og 2014) til K. M., og yder i støtte til videnskabelig forskning fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og Teknologi, Japan (16K 15625 til Y. K. og 16K 15598 til M.G.). Vi er især taknemmelige for alle medlemmer af Dept. af Coloproctological kirurgi og molekylære patologi for nyttige diskussioner og teknisk support. Vi takker også Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University School Medicine) og Dr. Hideki Kitajima (International University for sundhed og velfærd) for generøse teknisk vejledning i de kirurgiske procedurer for orthotopic implantation ind i musene og Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) for teknisk rådgivning om udførelse af tumor organoid kultur.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O’Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
