רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס
Summary
כדי לאפשר זיהוי רגישה מאוד של סרטן המעי הגס האנושי disseminating (CRC) תאים להמדינות רקמות, במסמך זה נראה עבור התמרה חושית יעילה של חלקיקים lentiviral חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך תאים תא צורב PDX-derived CRC פרוטוקול לפני הזרקת שלהם לתוך עכברים הנמען, עם תצפית מיקרוסקופית סטריאו-זריחה.
Abstract
למרות ההתקדמות הנוכחי בטיפול בסרטן המעי הגס האנושי (CRC), כמה טיפולים קיצוניים יעילים לשלבים מאוחר של CRC. כדי להתגבר על האתגר הזה קליניים, גידול xenograft העכבר מודלים באמצעות שורות תאים ותיקה קרצינומה של האדם והעכבר הטרנסגניים רבים פותחו מודלים עם גידולים כמו במודלים פרה. הם חלקית לחקות את התכונות של האנושי קרצינומה, אך לעיתים קרובות אינם מצליחים לסכם היבטים מרכזיים של ממאירות האנושי כולל פלישה גרורות. לפיכך, מודלים חלופיים שמייצגים יותר את התקדמות ממאיר ב CRC האנושי יש כבר המיוחל.
במסמך זה אנו מראים לדור של החולה, נגזר הגידול xenografts (PDXs) על ידי השתלה תת עורית של קטעים CRC קטן בניתוח גזור מן המטופל. המעי הגס PDXs לפתח ומזכירים histopathologically ה-CRC אצל המטופל. עם זאת, כמה micrometastases ספונטנית הן לזיהוי ב חתכים קונבנציונאלי איברים רחוקים המושפעת במודל PDX. כדי להקל על זיהוי גרורתי הפצתו לתוך איברים רחוקים, אנו מופק לתאי הגידול תא צורב PDXs המעי הגס בתרבות, נגוע אותם GFP lentivirus לפני זריקה לתוך IL2Rγ הנד/שי-scid מאוד immunodeficientnull (ליקר) עכברים. תא צורב CRC נגזר PDX Orthotopically מוזרק תאים באופן עקבי טופס גידולים ראשוני חיובי עבור GFP בעכברים הנמען. יתר על כן, באופן ספונטני פיתוח micrometastatic מושבות לבטא GFP מזוהים בעיקר בריאות של עכברים אלה על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. יתר על כן, intrasplenic הזרקה של CRC organoids לעתים קרובות מייצר הכבד מושבת. ממצאים אלה מצביעים יחדיו, על מתויג-GFP CRC PDX-derived תא צורב התאים להיות ויזואלית לזיהוי במהלך תהליך רב-שלבי, כינה את המפל הפלישה-גרורות. הפרוטוקולים שתואר כוללים הקמת PDXs של CRC האנושי והתרבות תלת-ממד לתאים המתאימים CRC תא צורב transduced על ידי חלקיקים lentiviral GFP.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) הוא הסיבה המובילה השניה של סרטן מקרי מוות ברחבי העולם1. התגובה לא מספיק טיפולים קונבנציונליים של חולים עם מחלה בשלב מתקדם מציין לחוסר היעילות של ניסיונות לרפא באופן קיצוני CRCs. כדי לפתח גישות טיפוליות יעיל יותר, הוקמו דגמים פרה העכבר שונים של סרטן המחקים את המאפיינים של CRCs. שורות תאים שונים של CRC היה בשימוש נרחב ליצירת הגידול xenografts עקב שלהם נוחות וקלות תפעול. תרבות לטווח ארוך של שורות תאים סרטן, עם זאת, לעיתים קרובות גורמת הבחירה של אוכלוסיות תאים ייחודיות כי הם די proliferative תחת תנאי תרבות מסוימת, ובכך וכתוצאה מכך תוצאות לא אמין והמגבלות מכריע הסם פרה פיתוח.
מבלי בתרבית במבחנה, החולה נגזר הגידול xenografts (PDXs) גם שהיא נוצרה על-ידי ההשרשה לתוך מודלים חייתיים של רקמות CRC בניתוח גזור מן המטופלים-2,–3,–4. PDXs מזוהים באופן נרחב recapitulating histopathological התכונות הגדולות ולהציג שינויים גנטיים במקור בגידולים של החולים שממנו הם נשאבו. יתר על כן, organoids החולה נגזר הגידול מורכב של תאים סרטניים אשכולות הוקמו על ידי תרבות בתנאים תלת-ממד זה מקרוב ממש מחקה את תכונות ביולוגיות של5,גידולים המקורי6. אלה organoids הגידול הוחלו גם על תפוקה גבוהה והתרופות הקרנה, ובכך לאפשר טיפולים אישית להיות מעוצב5. עם זאת, במידה ניכרת הטרוגנית CRC אוכלוסיות מנועות להיות נוכח בתוך הגידול בנפח גדול. אוכלוסיות CRC מסוים עשוי באופן סלקטיבי להתרבות והרחב במהלך הסדרה בתוך vivo ו- in vitro לקשרי של קטעים PDX, גידול organoids, בהתאמה. זה יכול גם לאפשר את הכולל ביטוי גנים פרופילים ואת מצב גנטי/אפי CRCs המושפע לשינוי, ובכך וכתוצאה מכך דמיון מינימלי ה-CRC הורים.
החולה-derived CRC organoids ואלה מופק לא סרטני המעי הגס האנושי מתוכנן הנמל גם יש כבר מועסקים שילובים של מוטציות oncogenic לחקור את גולת הכותרת של תאים סרטניים אנושיים כשניסחתי הגידול הפלישה, גרורות 68,7,,9. עם זאת, נמוך מאוד השכיחות של גרורות ספונטנית הנובעות orthotopic השרשה של החולה-derived CRC לתוך עכברים immunodeficient, הפכה אותו קשה ללמוד את תהליך רב-שלבי של המפל הפלישה-גרורות הכולל המקומי הפלישה, intravasation, תחבורה למחזור הדם, extravasation, קולוניזציה של איברים רחוקים4,10. Micrometastasis כמו המיוצג על-ידי הגידול בתצהיר תא של ≤2 מ”מ, שהוקמה על ידי המטופל, נגזר organoids CRC, לעתים קרובות התעלמו ניתוח histopathological של קטעים מן המושפעים איברים רחוקים במודלים של העכבר ניסיוני. ויזואליזציה של micrometastases ספונטנית היה גם מינימלי ויוו בשל הקושי ביעילות ידביקו סמני פלואורסצנט תאים סרטניים תא צורב לפני ההזרקה שלהם לתוך עכברים הנמען. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול ביעילות מגלי GFP lentivirus לתאי תא צורב CRC PDX-derived בתרבות 3D לפני זריקה לתוך עכברים הנמען ולאפשר זיהוי רגישה מאוד, העסקת מיקרוסקופ סטריאו-זריחה, של שלהם קולוניזציה של איברים שונים כדי טופס micrometastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות דגם CRC PDX כבר מועסקים נרחב ללמוד הגידול העיקרי, אם המודל הזה הוא גם ישים חוקרת גרורות הגידול יש לא עדיין היה מלא מבואר. גרורות ספונטנית היו גם בקושי לזיהוי הכבד, הריאות של שונים דווח על המעי הגס PDX מודלים4,10. כדי לזהות micrometastases עם רגישות גבוהה, פיתחנו פרוטו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Juntendo אוניברסיטת יאנג החוקר בפרס (2013, 2014 2015) בן, את משותפת פרוייקט פרס (2013 ו- 2014) ק מ, ומענקים בסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, טכנולוגיה, יפן (16 15625 K כדי י’ ק’ ו- 16K 15598 ל מ. ג). אנו מודים במיוחד לכל חברי החוג לכירורגיה Coloproctological של פתולוגיה מולקולרית שימושי לדיונים ותמיכה טכנית. אנו מודים גם ד ר הירויוקי Konno (המלונות בהם צפיתי אוניברסיטת Schoolof ברפואה) ואת ד ר הידקי קיטאג’ימה (אוניברסיטת הבינלאומי לבריאות ורווחה) להדרכה טכני נדיב הניתוחים להשתלה orthotopic לתוך עכברים, ד ר. Yoshitaka היפו (מרכז הסרטן צ’יבה) לקבלת ייעוץ טכני אודות ביצוע התרבות תא צורב הגידול.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O’Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
