GFP レンチ ウイルス導入オルガノイド培養患者由来大腸腫瘍によって生成される微小の高感度検出
Summary
CRC の PDX 由来器官毛細細胞に緑色蛍光タンパク質 (GFP) レンチ ウイルス粒子の効率的な伝達のためのプロトコルを示す本普及のひと大腸癌の高感度検出 (CRC) 細胞組織を植民地化をできるように、ステレオ蛍光顕微鏡による観察で、受信者のマウスに注入する前に。
Abstract
ひと大腸癌 (CRC) 治療の現在の進歩、にもかかわらずいくつかの根本的な治療法は、CRC の後期段階の効果的です。前臨床モデルとして老舗ひと癌細胞および腫瘍モデルが開発されている多くのトランスジェニック マウスを用いた腫瘍異種移植マウス モデルこの臨床の課題を克服。彼らは人間の癌の特徴を部分的に模倣が、ひと悪性腫瘍の浸潤・転移などの重要な側面を要約する失敗多くの場合。したがってより良い人間の crc の悪性進展を表す代替モデルが待望の。
本患者の解剖学的 CRC 小片の皮下注入による患者由来腫瘍異種移植片 (PDXs) の生成を紹介します。PDXs が開発し、病理組織学的患者に CRC のようなコロン。ただし、いくつかの自発的な微小は PDX モデルで影響を受ける臓器の断面を従来の検出です。遠隔臓器に転移普及の検出を容易にする文化でコロン PDXs から腫瘍における細胞を抽出し、高度免疫不全の合図/市-scid IL2Rγ への注入前に GFP レンチを使って感染null(NOG) マウス。注入がん PDX 派生 CRC 器官毛細細胞一貫してフォーム原発腫瘍陽性 GFP の受信者マウスで。また、gfp の植民地、特に蛍光顕微鏡による検出これらのマウスの肺に微小転移を自発的に開発。また、CRC オルガノイドの脾内注入はよく肝植民地化を生成します。一緒に取られて、これらの調査結果は、マルチ ステップ プロセス中に視覚的に検出する CRC の PDX の派生器官毛細細胞を GFP 標識呼ぶ転移カスケードを示します。記述されていたプロトコルには、人間の CRC の PDXs と GFP レンチ ウイルス粒子によって導入対応する CRC 器官毛細細胞の三次元培養の確立が含まれます。
Introduction
大腸がん (CRC) は、がん死亡世界中1の 2 番目の主要な原因です。進行期疾患患者の慣習的な療法への不十分な応答では、Crc を根本的に治すための試みの非効率を示します。効果的な治療法を開発し、様々 な臨床癌のマウスモデル Crc の特徴を模倣するが設けられています。各種 CRC 細胞株は、その利便性と操作の容易さのため腫瘍異種移植片を生成するため広く使用されています。癌細胞の長期培養ただし、多くの場合それによって信頼性の低い成果と臨床薬で重要な制限の結果が特定のカルチャ条件下ではかなり増殖、一意のセルの人口の選択は、します。開発。
生体外で培養されることがなく患者由来腫瘍異種移植片 (PDXs) は患者2,3,4から解剖学的生体 CRC の動物モデルへの注入によっても生成されています。PDXs は、主要な病理組織学的特徴を概説として広く認識されて、遺伝子変異はもともと由来されていた患者の腫瘍の存在します。また、患者由来の腫瘍オルガノイド クラスターは密接に元の腫瘍5,6の生物学的特性を模倣する 3 D の条件の下で文化によって確立された腫瘍細胞から成り立っています。これらの腫瘍 organoids も高スループットの薬剤のスクリーニング、により設計された5パーソナライズされた治療法適用。ただし、著しく異種 CRC 集団が腫瘍内に存在すると見なされます質量。特定 CRC 集団が選択的に増殖し、PDX と腫瘍オルガノイドの通路の生体内および生体外でのシリーズの間にそれぞれ展開します。これもできる全体的な遺伝子発現プロファイルと変更は、影響を受ける Crc のエピ/遺伝的状態により親の crc 値が最小の類似に 。
患者由来 CRC organoids と非癌性のひと大腸発癌性突然変異の組み合わせは、ひと腫瘍細胞の浸潤・転移の特徴を調査するため採用されている港に設計から抽出したもの6,7,8,9。ただし、自然転移を生じた患者由来の CRC の同所性同種移植免疫不全マウスの非常に低い発生率困難になっているを含む転移の翼列の多段階の過程を研究するローカル侵略、intravasation、血流、血管外漏出および遠隔臓器4,10の植民地化で輸送。微小転移として 2 mm の腫瘍細胞の沈着によって表される、CRC オルガノイドの患者由来によって形成される、セクション マウスの実験モデルで影響を受ける臓器からの病理組織学的解析でしばしば見過ごされています。自発的な微小の可視化もされている最小限生体内で効率的に受信者のマウスに注入する前に腫瘍における細胞に蛍光マーカーを導入の難しさのため。本研究で我々 プロトコルを開発した受信者マウスへの注入の前に 3 D 培養 PDX 派生 CRC 器官毛細細胞に GFP のレンチ ウイルスを効率的に変換し、高感度検出のステレオ蛍光顕微鏡を用いた、異なるフォームの微小器官の植民地化。
Protocol
Representative Results
Discussion
原発腫瘍の成長を研究する CRC PDX モデルが広く採用されているがこのモデルがまた腫瘍の転移を調査対象かどうかはまだ解明されていない完全に。自発転移は肝臓や肺の様々 な報告された PDX コロン モデル4,10でかろうじて検出可能も。微小を高感度に検出、PDX 派生 CRC オルガノイドの同所性同種および受信者マウスに静脈注射する前に GFP レンチ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品、順天堂大学若手研究者賞 (2013、2014、2015) y. o.、K. M. に共同プロジェクト受賞 (2013、2014) によって支えられた、教育省、文化、スポーツ、科学研究のための援助を与えると技術、日本 (Y ・ K に 16 K 15625 と m. g. に 16 K 15598)。特に有益な議論と技術サポート Coloproctological 外科、分子病理のすべてのメンバーに感謝しています。我々 はまたマウスと Dr に同所性同種移植の手術の技術ガイダンスについて寛大な今野弘之博士 (浜松大学医学部) と博士秀樹北島 (国際医療大学・福祉) をありがとうございます。孝カバ (千葉県がんセンター)、腫瘍培養の実行に関する技術的なアドバイスをします。
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
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| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
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