Haute sensibilité détection des micrométastases générés par GFP Lentivirus-transduites organoïdes cultivé à partir d’une tumeur du côlon dérivé de Patient
Summary
Pour permettre une détection très sensible de la diffusion du cancer colorectal humain cellules (CRC) qui colonisent les tissus, nous montrons ici un protocole pour la transduction efficace des Particules Lentivirales protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules organoïde CRC PDX-dérivés avant leur injection à des souris bénéficiaires, avec l’observation au microscope stéréo-fluorescence.
Abstract
Malgré les progrès actuels dans le traitement du cancer colorectal humain (CRC), quelques traitements radicaux sont appliquent aux derniers stades du CRC. Pour surmonter ce défi clinique, les modèles de souris de xénogreffes tumorales utilisant longtemps lignées de cellules de carcinome humain et de nombreux modèles de souris transgéniques présentant des tumeurs ont été développés dans des modèles précliniques. Partiellement imiter les caractéristiques des carcinomes humaines, ils omettent souvent de récapituler les principaux aspects des malignités humaines y compris l’invasion et la métastase. Ainsi, des modèles alternatifs qui représentent mieux la progression maligne dans CRC humaine ont longtemps été attendus.
Nous montrons dans la présente génération de xénogreffes tumorales dérivées de patient (PDXs) par l’implantation sous-cutanée de petits fragments CRC chirurgicalement découpé d’un patient. Le colon PDXs développer et examen histopathologique ressemblent à la CDE chez le patient. Cependant, quelques micrométastases spontanées sont détectables dans les coupes classiques des organes éloignés touchés dans le modèle PDX. Afin de faciliter la détection d’une dissémination métastatique dans des organes éloignés, nous organoïde cellules tumorales extraites des PDXs du côlon en culture et infectés par le lentivirus GFP avant injection dans fortement immunodéprimé Shi-NOD/scid IL2Rγ null Souris (NOG). Orthotopically injecté PDX-dérivé CRC organoïde cellules constamment forme tumeurs primaires positifs pour GFP chez les bénéficiaires. En outre, spontanément au point micrometastatic colonies exprimant GFP sont notamment détectés dans les poumons de ces souris par microscopie de fluorescence. Par ailleurs, l’injection intra-splénique de CRC organoïdes produit fréquemment colonisation hépatique. Pris ensemble, ces résultats indiquent GFP-étiqueté des cellules dérivées de PDX CRC organoïde d’être visuellement détectable au cours d’un processus multipas appelle la cascade d’invasion-métastase. Les protocoles décrits incluent l’établissement de PDXs de CDE humaine et de la culture 3D des correspondants CRC organoïde cellules transduites par Particules Lentivirales GFP.
Introduction
Cancer colorectal (CCR) est la deuxième cause de cancer décès dans le monde1. Une réponse insuffisante à des thérapies conventionnelles des patients atteints de la maladie de stade avancé indique l’inefficacité des tentatives pour guérir radicalement Croix-Rouge canadienne. Pour développer des approches thérapeutiques plus efficaces, divers modèles de souris préclinique du cancer qui imitent les caractéristiques du CRC ont été établis. Diverses lignées cellulaires CRC ont été largement utilisées pour générer des xénogreffes tumorales en raison de leur commodité et facilité de manipulation. Culture à long terme des lignées de cellules cancéreuses, cependant, provoque souvent la sélection unique de populations de cellules qui sont tout à fait proliférative sous une condition de culture particulière, entraînant ainsi des résultats peu fiables et des limitations cruciales dans le médicament préclinique développement.
Sans être cultivées in vitro, xénogreffes tumorales dérivées de patient (PDXs) ont également été générés par implantation dans des modèles animaux de tissus humains de CRC chirurgicalement disséqués des patients2,3,4. PDXs sont largement reconnus comme récapitulant les principales caractéristiques histopathologiques et altérations génétiques présent initialement dans les tumeurs des patients dont ils sont dérivés. En outre, tumeur dérivée de patient organoïdes composée de cellule tumorale grappes ont été établies par la culture dans des conditions 3D étroitement imité les propriétés biologiques de l’origine des tumeurs5,6. Ces organoïdes de tumeur ont été également appliqués au dépistage de drogue de haut débit, permettant ainsi aux thérapies personnalisées être conçu5. Cependant, les populations de CRC fortement hétérogènes sont censées pour être présents au sein d’une tumeur masse. Populations particulières de CRC peuvent sélectivement prolifèrent et développer au cours de la série in vivo et in vitro des passages de PDX et tumeur organoïdes, respectivement. Cela peut permettre également le général profils d’expression génique et le statut epi/génétique de la SCCR touchée à changer, entraînant ainsi dans la ressemblance minime à la CRC parental.
Dérivé de patient organoïdes CRC et celles extraites du côlon humain non cancéreuse, conçu pour le port de combinaisons de mutations oncogéniques ont également été employées pour étudier les caractéristiques des cellules tumorales humaines incarnées par invasion tumorale et les métastases 6,7,8,9. Cependant, la très faible incidence de métastases spontanées découlant de l’implantation orthotopique du CRC dérivé de patient dans des souris immunodéficientes, a rendu difficile d’étudier le processus multipas de la cascade d’invasion-métastases comprenant local invasion, intravasation, transport dans la circulation sanguine, l’extravasation et la colonisation des organes éloignés4,10. Micrométastase comme représenté par le dépôt de cellules tumorales de ≤2 mm, formé par patient dérivé CRC organoïdes, a souvent été négligé sur l’analyse histopathologique des coupes d’organes éloignés touchés dans des modèles expérimentaux de souris. Visualisation des micrométastases spontanée a été minime en vivo en raison de la difficulté d’introduire efficacement les marqueurs fluorescents dans les cellules tumorales organoïde avant leur injection à des souris destinataires. Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour transmettre efficacement lentivirus GFP dans des cellules organoïde CRC PDX-dérivé dans la culture 3D avant l’injection à des souris destinataires et pour permettre la détection très sensible, employant stéréo-fluorescence microscopy, de leur colonisation des différents organes de forme micrométastases.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que le modèle CRC PDX a été largement utilisé pour étudier la croissance de la tumeur primitive, si ce modèle s’applique également à une enquête sur les métastases tumorales n’a pas encore été complètement élucidé. Métastases spontanées étaient également à peine détectables dans le foie et les poumons des divers rapportés du côlon PDX modèles4,10. Pour détecter les micrométastases à haute sensibilité, nous avons développé un p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 et 2015) à ans, le prix de projet conjoint (2013 et 2014) à M. K. et accorde à-aides à la recherche scientifique depuis le ministère de l’éducation, Sports, Culture, Science et Technologie, Japon (16 15625 K et K. Y. et 16K 15598 à M.G.). Nous sommes particulièrement reconnaissants à tous les membres du département de chirurgie coloproctogiques et pathologie moléculaire pour des discussions fructueuses et support technique. Nous remercions également m. Hiroyuki Konno (Hamamatsu Université école médecine) et Dr Hideki Kitajima (Université internationale de la santé et du bien-être social) généreux conseils techniques dans les procédures chirurgicales d’implantation orthotopique en souris et Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) pour des conseils techniques sur l’exécution de la culture d’organoïde tumeur.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
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