Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt
Summary
Um hochempfindliche Detektion der Verbreitung von menschlichen colorectal Krebses (CRC) Zellen Gewebe besiedeln können, zeigen wir hier ein Protokoll zur effizienten Transduktion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Lentivirale Partikel in PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen vor der Injektion in Empfänger Mäuse mit Stereo-Fluoreszenz-mikroskopische Beobachtung.
Abstract
Trotz aktueller Fortschritte in der Behandlung der menschlichen kolorektalen Karzinoms (CRC) sind einige radikale Therapien effektiv für den späten Stadien der CRC. Zur Überwindung dieser klinische Herausforderung, Tumor-Xenograft-Maus-Modellen alteingesessenen mit menschlichen Karzinom-Zell-Linien und viele transgenen Mausmodellen mit Tumoren wurden als präklinischen Modellen entwickelt. Sie teilweise die Funktionen der menschlichen Karzinome zu imitieren, aber oft nicht auf die wesentlichen Aspekte der menschlichen Tumoren einschließlich Invasion und Metastasierung zu rekapitulieren. Alternative Modelle, die besser die maligne Progression in menschlichen CRC darstellen sind so lange erwartet worden.
Wir zeigen hier Generation von Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) durch subkutane Implantation von kleinen CRC-Fragmente von einem Patienten chirurgisch seziert. Der Doppelpunkt, den pdxs entwickeln und histopathologisch ähneln die CRC des Patienten. Allerdings sind einige spontane Fixierungsprotokoll nachweisbar in konventionellen Querschnitte der betroffenen entfernte Organe des PDX-Modells. Um die Erkennung von metastasierendem Verbreitung in entfernten Organen zu erleichtern, wir Doppelpunkt PDXs in Kultur organoide Tumorzellen entnommen und mit GFP Lentivirus vor der Injektion in stark immungeschwächte NOD/Shi-scid IL2Rγ infiziertNull (NOG) Mäuse. Orthotopically injiziert PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen konsequent Form Primärtumoren positiv für GFP im Empfänger Mäuse. Darüber hinaus entwickeln spontan Micrometastatic, die Kolonien mit dem Ausdruck GFP vor allem in den Lungen von diesen Mäusen durch Fluoreszenzmikroskopie erkannt werden. Darüber hinaus produziert intrasplenic Injektion von CRC Organellen häufig hepatische Kolonisation. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse GFP gekennzeichnet PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen visuell erkennbaren in einem mehrstufigen Prozess werden die Invasion Metastasierung Kaskade genannt. Die beschriebenen Protokolle gehört die Einrichtung der PDXs der menschlichen CRC und 3D Kultur der entsprechenden CRC organoide Zellen durch GFP Lentivirale Partikel ausgestrahlt.
Introduction
Kolorektales Karzinom (CRC) ist die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit1. Die unzureichende Reaktion auf konventionelle Therapien von Patienten mit fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung zeigt die Unwirksamkeit der Versuche, CRCs radikal zu heilen. Um eine effektivere therapeutische Ansätze zu entwickeln, entstanden verschiedene präklinische Mausmodelle von Krebs, die die Eigenschaften des SFB zu imitieren. Verschiedene CRC-Zell-Linien wurden weithin zur Tumor Xenografts aufgrund ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Manipulation zu generieren. Langfristige Kultur von Krebszelllinien, führt jedoch oft zu Auswahl an einzigartigen Zell-Populationen, die ziemlich proliferative unter einer bestimmten Kultur Bedingung, damit was zu unzuverlässigen Ergebnissen und entscheidende Einschränkungen in präklinischen Droge Entwicklung.
Ohne kultiviert in Vitro, wurden auch durch Implantation in Tiermodellen der CRC Gewebe chirurgisch seziert von Patienten2,3,4Patienten abgeleitet Tumor Xenografts (PDXs) generiert. PDXs sind weithin als Rekapitulation der histopathologischen Haupteigenschaften und genetische Veränderungen, die ursprünglich in Tumoren der Patienten, von denen sie abgeleitet wurden. Darüber hinaus bestehend Patienten abgeleitet Tumor Organellen aus Tumorzellen, die Cluster von Kultur unter 3D Bedingungen entstanden, die genau die biologischen Eigenschaften des ursprünglichen Tumoren5,6nachgeahmt. Dieser Tumor Organellen wurden auch für Hochdurchsatz-Drogen-Screening, wodurch personalisierte Therapien gestaltete5übernommen. Jedoch deutlich heterogene CRC-Populationen sind davon ausgegangen, dass innerhalb eines Tumors sein Masse. Bestimmte CRC Populationen könnte gezielt vermehren und während der in Vivo und in Vitro Reihe von Passagen des PDX und Tumor Organellen, bzw. zu erweitern. Dies kann die gesamte gen expressionsprofile und Epi/genetischen Status der betroffenen CRCs zu verändern, auch damit was zu minimalen Ähnlichkeit mit der elterlichen CRC.
Patienten-abgeleitete CRC Organellen und diejenigen extrahiert aus noncancerous menschlichen Dickdarm zum Hafen, die Kombinationen von Onkogenen Mutationen auch beschäftigt sind, zu untersuchen, die Kennzeichen der menschlichen Tumorzellen von Tumorinvasion und Metastasierung beispielhaft entwickelt 6,7,8,9. Jedoch hat die sehr niedrige Inzidenz von spontanen Metastasen aus orthotopen Implantation des Patienten abgeleitet CRC in immungeschwächte Mäuse es schwierig gemacht, mehrstufigen Prozess der Invasion Metastasierung Kaskade zu studieren, die enthält lokale Invasion, Intravasation, Transport in der Blutbahn, Extravasation und Besiedlung von entfernten Organen4,10. Micrometastasis als Prozessbevollmächtigte Tumor Zelle Ablagerung von ≤2 mm, durch Patienten abgeleitet CRC Organellen gebildet, wurde histopathologischen Analyse der Abschnitte von betroffenen entfernte Organe in experimentellen Mausmodellen oft übersehen. Visualisierung von spontanen Fixierungsprotokoll wurde auch minimal in Vivo aufgrund der Schwierigkeiten der Tumorzellen organoide vor deren Injektion Empfänger Mäuse effizient fluoreszierenden Marker einzuführen. In dieser Studie entwickelt wir ein Protokoll, um effizient GFP Lentivirus in 3D Culture vor der Injektion in Empfänger Mäuse PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen transduzieren und hochempfindlichen Erkennung ermöglichen Einsatz Stereo-Fluoreszenz-Mikroskopie, der ihre Besiedlung der verschiedenen Organe zu Form Fixierungsprotokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl das CRC PDX-Modell weithin eingesetzt worden, hat um primäre Tumorwachstum zu studieren, ob dieses Modell auch für Tumor Metastasen zu untersuchen gilt hat nicht noch nicht vollständig aufgeklärt. Spontane Metastasen waren auch kaum nachweisbar in Leber und Lunge von verschiedenen gemeldeten Doppelpunkt PDX Modelle4,10. Um Fixierungsprotokoll mit hoher Empfindlichkeit zu erkennen, haben wir ein Protokoll für transducing GFP Lentivirale Partikel in CRC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der Juntendo University Young Investigator Award (2013, 2014 und 2015) Y.O., das gemeinsame Projekt Award (2013 und 2014), K. M., und gewährt in Beihilfen für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technology, Japan (16K 15625, Y. K. und 16K 15598, M.G.). Wir sind besonders dankbar für alle Mitglieder der Abt. für Coloproctological Chirurgie und Molekularpathologie für nützliche Diskussionen und technischen Support. Wir danken auch Dr. Hiroyuki Konno (Hamamatsu University Schoolof Medicine) und Dr. Hideki Kitajima (Internationale Hochschule für Gesundheit und Soziales) für großzügige fachliche Anleitung in den chirurgischen Verfahren zur orthotopen Implantation in Mäusen und Dr. Yoshitaka Hippo (Chiba Cancer Center) für technische Beratung bezüglich die Tumor organoide Kultur durchführen.
Materials
| NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG) mice | The Central Institute for Experimental Animals,Kanagawa, Japan | Breed 6-week-old male mice under germ-free and specific pathogen-free conditions | |
| wound clips 2×10mm |
Natsume manufacturing, Japan | #C-21-S | Autoclave before use |
| Hamilton syringe needle size:22 gauge |
Tokyo Science, Japan | Disinfect with 70% alcohol and sterile PBS. | |
| 6-well plate | BMBio | #92006 | |
| 12-well plate | BMBio | #92412 | |
| 15ml conical tube | Sumitono Bakelite | MS-57150 | |
| 50ml conical tube | Sumitomo Bakelite | MS-57500 | |
| microtube | Eppendorf | #0030120086 | Autoclave before use |
| Hemocytometer | Erma | #03-202-1 | |
| 40μm cell strainer | Corning | #352340 | |
| Matrigel basement membrane matrix | Corning | #354234 | Store aliqupts at -20°C. Place on ice until use |
| Collagenase type 1 | Sigma | #C1030 | 150 mg/ml collagenase type1 in 1×PBS. Store aliqupts at -20°C for up to 1 year |
| Accutase | Innovate Cell Technologies | #5V2623A | Store at 4°C. |
| DMEM/F-12 with GlutaMAX™ | Gibco | #10565018 | Store at 4°C. Warm at 37°C before use |
| Cell banker 1plus | ZENOAQ | #628 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Penicillin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| Streptomycin | Gibco | #15140122 | Store at 4°C. Use within 1 month |
| hEGF | PEPROTECH | #AF-100-15 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Y27632, a ROCK inhibitor | Wako | #253-00591 | Store at -20°C. Add to medium on same day as use |
| Culture medium | Gibco | DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement supplemented with 5% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Store at 4°C. Use within 1 month. |
|
| CRC organoid culture medium with 1% or 5% FCS |
DMEM/F-12 with GlutaMAX™ supplement (Gibco #10565018) supplemented with 1% or 5% FCS, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 2 ng/ml hEGF and 10 µM Y27632, a ROCK inhibitor. Store at 4°C. Use within 1 month. |
||
| the FuGENE 6 transfection regent | Roche | 11814 443001 | |
| Minisart 0.45 µm filter | Sartorius stedim | 17598-K | |
| 5 ml polypropylene centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326819 | |
| PRRL-GFP vector | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-VSV-G | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| pCMV-dR8.2 dvpr | Gift from Dr. Robert A. Weinberg | ||
| the SW55Ti swinging bucket rotor | Beckman Coulter | ||
| a Zeiss Axioplan 2 stereo-fluorescence microscope | Zeiss |
References
- Siegel, R., Desantis, C., Jemal, A. Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin. 64 (2), 104-117 (2014).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Aparicio, S., Hidalgo, M., Kung, A. L. Examining the utility of patient-derived xenograft mouse models. Nat Rev Cancer. 15 (5), 311-316 (2015).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clin Cancer Res. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Fujii, M., et al. A Colorectal tumor organoid library demonstrates progressive loss of niche factor requirements during tumorigenesis. Cell Stem Cell. 18 (6), 827-838 (2016).
- Fumagalli, A., et al. Genetic dissection of colorectal cancer progression by orthotopic transplantation of engineered cancer organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2357-E2364 (2017).
- O’Rourke, K. P., et al. Transplantation of engineered organoids enables rapid generation of metastatic mouse models of colorectal cancer. Nat Biotechnol. 35 (6), 577-582 (2017).
- Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nat Biotechnol. 35 (6), 569-576 (2017).
- Kuo, T. H., et al. Liver colonization competence governs colon cancer metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (26), 12085-12089 (1995).
- Onuma, K., et al. Genetic reconstitution of tumorigenesis in primary intestinal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (27), 11127-11132 (2013).
- Onder, T. T., et al. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Res. 68 (10), 3645-3654 (2008).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am J Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Fujii, E., et al. Characterization of EBV-related lymphoproliferative lesions arising in donor lymphocytes of transplanted human tumor tissues in the NOG mouse. Exp Anim. 63 (3), 289-296 (2014).
