Summary

Kanüle Implantation in die Cisterna Magna von Nagetieren

Published: May 23, 2018
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Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der Cisterna Magna Kanülierung (CMc), minimalinvasiv, Tracer, Substrate und Signalmoleküle in den Liquor cerebrospinalis (CSF) zu liefern. In Kombination mit verschiedenen Bildgebungsverfahren ermöglicht CMc Glymphatic System sowie CSF Dynamik Bewertung und Gehirn-weite Lieferung verschiedener Verbindungen.

Abstract

Cisterna Magna Kanülierung (CMc) ist ein einfaches Verfahren, das direkten Zugriff auf die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne operativen Schäden an den Schädel oder das Gehirn Parenchym ermöglicht. Bei anästhesierten Nagetieren ermöglicht die Belichtung der Dura Mater durch stumpfe Dissektion der Nackenmuskulatur das einführen der Kanüle in die Cisterna Magna (CM). Die Kanüle, komponiert, entweder durch einen feinen abgeschrägten Nadel oder Borosilikatglas Kapillare, ist über einen Schlauch Polyethylen (PE) eine Spritze befestigt. Über eine Spritzenpumpe, können Moleküle dann kontrollierten Preisen direkt in die CM injiziert werden kontinuierlich mit den Subarachnoidalraum ist. Aus dem Subarachnoidalraum können wir CSF Fluten durch konvektive Strömung in den perivaskulärer Raum um eindringende Arteriolen verfolgen, wo gelöste Austausch mit der interstitiellen Flüssigkeit (ISF) erfolgt. CMc kann für akute Injektionen unmittelbar nach der Operation oder für eine chronische Implantation, mit späteren Injektion betäubt oder wach, erfolgen frei beweglichen Nagetiere. Quantifizierung der tracerverteilung im Gehirn Parenchym erfolgt durch Epifluoreszenz, 2-Photonen-Mikroskopie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI), abhängig von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der injizierten Moleküle. CMc in Verbindung mit verschiedenen bildgebenden Verfahren bietet damit ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des Glymphatic Systems und CSF Dynamik und Funktion. CMc kann darüber hinaus genutzt werden, als Kanal für schnelle, Gehirn-weite Lieferung der Signalisierung Moleküle und metabolische Substrate, die die Blut-Hirn-Schranke (BBB) sonst nicht überqueren konnte.

Introduction

Liquor cerebrospinalis (CSF) taucht das zentrale Nervensystem (ZNS) in das Ventrikelsystem und entlang der Subarachnoidalblutung Räume, ein anatomisch definierten Raum im Kontinuum mit der Ventrikel, die das Gehirn und das Rückenmark umgibt. Eine der Hauptfunktionen des GFK ist eine Route für die Abfertigung von Metaboliten und gelösten Stoffen aus der Anwesenheit von zur Verfügung zu stellen. Abstand wird über die kürzlich entdeckten Glymphatic System1, das Gehirn, die analog zu den peripheren lymphatischen Systems erleichtert. Hierin, wir beschreiben und erläutern die Cisterna Magna Kanülierung (CMc), eine minimal-invasive Methode für die direkte Übergabe von Molekülen in den Liquor. CMc ist die zentrale Methode zur Untersuchung der Glymphatic-Funktion. CMc kann darüber hinaus auch für das Studium der CSF Dynamik und für eine schnelle, Gehirn-weite Lieferung nicht Blut Hirn-Schranke (BBB) durchlässig Moleküle in das Gehirn Parenchym, entlang der perivaskulärer Raum angewendet werden.

Die CMc nutzt physiologische Grundsätze der CSF Bewegungsdynamik durch die CNS, beschriftete Tracer Moleküle oder Drogen in den CSF gefüllten Raum der Cisterna Magna (CM) zu liefern. Moleküle sind über eine Kanüle in die Atlas-okzipitalen dural Membran-Abdeckung, die die CM. Moleküle dann von CSF Masse fließen über den Paravascular Platz1in der Anwesenheit durchgeführt werden implantiert eingespritzt. Tracer oder Kontrast-Agent über die CMc injiziert folgt der Bewegung des CSF, wodurch die Beurteilung der CSF Bewegung und Glymphatic Zustrom durch Quantifizierung Intensitätsstufen beschrifteten Moleküle, die die Anwesenheit von eingeben. CMc ist kompatibel mit verschiedenen bildgebenden Verfahren einschließlich Epifluoreszenz, 2-Photonen-Mikroskopie und Magnetresonanz-Bildgebung (MRI). Auch diese Beurteilung kann in Vivo und ex Vivodurchgeführt. Wichtig ist, ermöglicht CMc die Visualisierung des Systems der Glymphatic unter Narkose oder im natürlichen Schlaf sowie bei wachen, frei beweglichen Tieren.

Die CMc-Technik kann genutzt werden, um verschiedene Aspekte der Strömungsmechanik im Liquor zu studieren, sondern erweist sich als besonders nützlich für das Studium des Glymphatic-Systems sein. Glymphatic Aktivität treibt die konvektive Strömung von CSF aus dem Periarterial Raum über Wasserkanäle Aquaporin-4 (AQP-4), die in der Membran der astrocytic vaskulären Umhüllung Endfeet angebunden sind. Die konvektive Strömung ermöglicht den Austausch von CSF und interstitielle Flüssigkeit (ISF) in das Gehirn Parenchym. CSF/ISF, Stoffwechselschlacken und gelösten Stoffen enthalten wird dann aus der in Anwesenheit von über den perivenöse Platz2,3entfernt. Letzten Endes erreicht CSF/ISF die Peripherie über die kürzlich beschriebenen dural Lymphgefäße4,5. Das Glymphatic System wurde entscheidend für die Abfertigung von schädlichen Abfällen Metaboliten wie Amyloid-β2gezeigt. Darüber hinaus ist Glymphatic Clearance beeinträchtigt Altern6, nach Schädel-Hirn-Verletzung-7, und in Tiermodellen der Diabetes-8 und der Alzheimer-Krankheit9. Bemerkenswert ist Glymphatic Aktivität Zustand abhängig, während Schlaf oder Anästhesie im Vergleich zu Wachheit1deutlich höheren Aktivität zeigen. In der Tat zeigen junge narkotisierten Tiere die höchste Glymphatic-Aktivität. Experimentellen Quantifizierung der Glymphatic Tätigkeit ist somit entscheidend ihre Rolle in Gesundheit und Krankheit zu studieren.

Mehrere Studien haben CSF Dynamik und ihren Austausch mit interstitielle Flüssigkeit (ISF) in das Gehirn Parenchym angesprochen. Die Methoden, die durch die beschrifteten Moleküle geliefert werden sind jedoch eher invasiv, Hirnschäden Parenchym und Änderungen in der intrakraniellen Druck (ICP) auslösen (siehe Bewertung10). Einige Beispiele sind intraventrikuläre oder Intraparenchymal Einspritzungen die Kraniotomie oder Bohren von einen Grat beinhalten Loch in den Schädel. Diese Verfahren wurden gezeigt, ICP, so stören Glymphatic Funktion2zu ändern. Auch solche invasiven Methoden induzieren Astrogliosis und AQP-4 Immunoreactivity in dem Hirnareal Parenchym beschädigt und seine Umgebung11,12zu erhöhen. Wie Astrozyten und AQP-4 Schlüsselelemente des Glymphatic Systems, ist die CMc die Methode der Wahl für seine Studien. Die wichtigsten Vorteile von CMc im Vergleich zu mehr invasiven Verfahren sind die Aufrechterhaltung einer intakten Schädel und Gehirn Parenchym, ICP Umbauten und Astrogliosis, bzw. zu vermeiden. So öffnet CMc in Verbindung mit anderen imaging-Tools für eine breite Palette von Möglichkeiten, nicht nur das Glymphatic-System, sondern auch die Dynamik zu studieren und Mechanismen der Flüssigkeitsströmung in Homöostase sowie in Tiermodellen der neurologischen Erkrankungen.

Cisterna Magna Kanülierung (CMc) Verfahren ermöglicht einfachen und direkten Zugriff auf die cerebrospinale Flüssigkeit (CSF). Durch die Injektion von verschiedener Molekülen (z.B. Fluoreszenz Tracer, MRT-Kontrastmittel) kann der Experimentator verfolgen ihre Bewegung innerhalb der CSF-Fach und die Aktivität des Glymphatic Systems zu bewerten. Das folgende Protokoll beschreibt sowohl die akuten CMc für Injektionen unmittelbar nach der Operation, und chronische Implantation der Kanüle, in der das Tier erholt sich von dem chirurgischen Eingriff für eine spätere Injektion. Der wichtigste Unterschied zwischen der akuten und chronischen Implantation ist, dass die chronische Implantation für das Studium der Glymphatic Aktivität bei Mäusen wach.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß der Europäischen Richtlinie 2010/63/EU für Tierversuche durchgeführt und waren von der Tier-Experimente-Rat unter das dänische Ministerium für Umwelt und Ernährung (2015-15-0201-00535) genehmigt. 1. Verfahren zur Kanülierung Kanüle VorbereitungHinweis: Berühren Sie die Kanüle mit unsterilen Handschuhen. Brechen Sie die abgeschrägte Metallspitze einer 30G dental Nadel Nadel Halterung befestigen. Mit einem Nadelhalter, ber…

Representative Results

Bei der Fixierung von Mäusen oder Ratten in einem stereotaktischen Rahmen sind die Nackenmuskulatur rund um die Region occipital Kamm unverblümt seziert, um die Cisterna Magna (CM) verfügbar zu machen. Die dreieckige Struktur des CM ist leicht zwischen dem kaudalen Teil des Kleinhirns und der Medulla (Abbildung 1A-1 C) anerkannt. Die Kanüle wird 1-2 mm in die CM eingefügt, durch sanft piercing die blockfreien-okzipitalen Membran (<strong…

Discussion

Wir haben ein Protokoll vorgelegt, die ein detailliertes Verfahren für Cisterna Magna Kanülierung (CMc), die bietet eine einfache Methode beschreibt um markierte Moleküle an das CSF-Fach zu liefern. CMc ermöglicht die spätere Visualisierung der CSF Dynamik, in Vivo und ex Vivo, mittels verschiedener bildgebender Verfahren oder Histologie.

Einer der Hauptvorteile der CMc-Technik liegt in einen direkten Zugang zum Subarachnoidalraum ohne die Notwendigkeit, das Gehirn von K…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch die Novo Nordisk Stiftung und National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NINDS/NIH (M.N) unterstützt. A.L.R.X. und S.H-R sind Empfänger von ein Postdoc-Stipendium und ein Promotionsstipendium der Lundbeck-Stiftung.

Materials

SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm Kulzer AA001
Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID Scandidact PE10-CL-500
30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock Chirana T. Injecta CHINS01
Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) Meda AS no catalogue number, see link in comments http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm Vitrex Medical A/S 520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha Ophtha 145250
Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) Heinz Herenz 1032018
Eye spears Medicom A18005
Ferric chloride 10% solution Algeos NV0382
Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers Kimberly Clark Professional 05511
Loctite Super Glue Precision 5g Loctite no catalogue number, see link in comments http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html 
Insta-Set CA Accelerator Bob Smith Industries BSI-152
Dental Cement Powder A-M Systems 525000
Surgical weld  Kent Scientific Corporation INS750391
Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock Hamilton syringes 1710TLL
LEGATO 130 Syringe pump KD Scientific 788130
Paraformaldehyde powder, 95% Sigma Aldrich 158127
Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) Sigma Aldrich P3813
Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate Thermo Fisher Scientific O34784

DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL)
Thermo Fisher Scientific 62248
Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic Thermo Fisher Scientific D3305
E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System E-Z Systems EZ-7000
Attane Isofluran 1000 mg/g ScanVet 55226
Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) ScanVet 545349
Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) Intervet International BV 511519
Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH 148999
Xylocain 20 mg/mL (lidocain) AstraZeneca 158543
Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) AstraZeneca 123918
Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) Richter Pharma AG 185159 

References

  1. Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
  2. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
  3. Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
  4. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
  5. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
  6. Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
  7. Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
  8. Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
  10. Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
  11. Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
  12. Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
  13. Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
  14. Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
  15. Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
  16. Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
  17. Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
  18. Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).

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Xavier, A. L., Hauglund, N. L., von Holstein-Rathlou, S., Li, Q., Sanggaard, S., Lou, N., Lundgaard, I., Nedergaard, M. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. J. Vis. Exp. (135), e57378, doi:10.3791/57378 (2018).

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