Канюля имплантации в Чистерна Magna грызунов
Summary
Здесь мы описываем протокол для выполнения Чистерна magna катетеризации (CMc), минимально инвазивная способ доставить трассировщиков, субстратов и сигнальных молекул в спинномозговой жидкости (СМЖ). В сочетании с различными визуализации формы, CMc позволяет glymphatic системы и оценки динамики спинномозговой жидкости, а также мозг всей доставки различных соединений.
Abstract
Чистерна magna катетеризации (CMc)-это простая процедура, которая обеспечивает прямой доступ к спинномозговой жидкости (CSF) без оперативного повреждения черепа или паренхимы мозга. В наркотизированных грызунов воздействия твердой мозговой оболочки, тупым диссекция шеи мышц позволяет вставлять канюли в Чистерна magna (см). Канюля, состоящий либо тонкой иглой скошенный или боросиликатное капилляров, прилагается через трубку в полиэтилен (PE) к шприцу. С помощью насоса шприца, молекулы могут затем быть введен контролируемой скоростью непосредственно в см, которая непрерывно с субарахноидальное пространство. Из субарахноидального пространства мы можем проследить потоки CSF конвективный поток в периваскулярной пространство вокруг проникающих артериол, где происходит обмен вещества с межклеточной жидкости (ISF). CMc может выполняться для острой инъекции сразу после операции, или хронический имплантации, с более поздних инъекции в наркотизированных или просыпаются, свободно перемещающихся грызунов. Количественный трассирующими распределения в паренхиме мозга может осуществляться эпифлуоресцентного, 2-Фотон микроскопии и магнитно-резонансная томография (МРТ), в зависимости от физико химических свойств вводят молекул. Таким образом CMc в сочетании с различными методами визуализации предлагает мощный инструмент для оценки системы glymphatic и динамики ФГО и функции. Кроме того CMc может использоваться в качестве канала для быстрого, мозг всей доставки сигнальной молекулы и метаболизма субстратов, которые иначе не могли пересечь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).
Introduction
Спинномозговой жидкости (CSF) ванны центральной нервной системы (ЦНС) в желудочковой системе и вдоль субарахноидального пространства, анатомически определенного пространства в континууме с желудочков, который окружает мозг и спинной мозг. Одна из основных функций спинномозговой жидкости является предоставить маршрут для оформления метаболитов и растворенных веществ из паренхимы мозга. Распродажа облегчается через недавно обнаружили glymphatic системы1, аналоговый периферийных лимфатической системы мозга. Здесь мы описать и обсудить Чистерна magna катетеризации (CMc), минимально инвазивный метод для прямой доставки молекул в спинномозговой жидкости. CMc является основным методом для изучения функции glymphatic. Кроме того CMc может также применяться для изучения динамики Ликвора и быстрый, мозг всей доставки-крови мозга барьера (ГЭБ) проницаемых молекул в паренхимы мозга, вдоль периваскулярные пространства.
CMc подвиги физиологических принципов динамики движения спинномозговой жидкости через ЦНС доставить помечены трассирующими молекул или наркотиков в СМЖ заполнить пространство Чистерна magna (см). Молекулы вводят через канюлю, имплантируется в Атлантическо затылочной дурального мембранного покрытия, что молекулы см. затем перевозится ФГО объемного потока в паренхиме мозга через пространство paravascular1. Трассирующими или контраст агент, вводят через CMc следует движение CSF, которая позволяет оценивать движение Ликвора и glymphatic приток путем количественного определения уровней интенсивности помечены молекул, которые вводят паренхимы мозга. CMc совместим с различные методы обработки изображений, включая эпифлуоресцентного, 2-Фотон микроскопии и магнитно-резонансная томография (МРТ). Кроме того, эта оценка может быть выполнена как в естественных условиях или ex vivo. Главное CMc позволяет для визуализации системы glymphatic под наркозом или во время естественного сна, а также в awake, свободно движущихся животных.
CMc методика может использоваться для изучения различных аспектов динамики жидкости в спинномозговой жидкости, но оказалась особенно полезной для изучения системы glymphatic. Glymphatic активность диски конвективный поток спинномозговой жидкости из пространства periarterial каналам воды Аквапорин-4 (AQP-4), которые на привязи в мембране Астроцитарная сосудов упаковка endfeet. Конвективный поток позволяет обмена Ликвора и межклеточной жидкости (ISF) в пределах паренхимы мозга. CSF/ISF, содержащие метаболические отходы и растворенных веществ затем удаляется из паренхимы мозга через2,perivenous в пространстве3. В конечном счете CSF/ISF достигает периферии через недавно описан дурального лимфатические сосуды4,5. Системы glymphatic было показано, имеют решающее значение для обезвреживания вредных отходов метаболитов например амилоид β-2. Кроме того Распродажа glymphatic нарушается в старения6, после черепно-мозговой травмы7и в животных моделях диабета8 и9болезни Альцгеймера. В частности glymphatic деятельность является государством зависимых, значительно выше активности во время сна или анестезии по сравнению с бодрствования1. Действительно осознающие молодняка экспонат наибольшая активность glymphatic. Таким образом экспериментально количественная оценка деятельности glymphatic имеет решающее значение при изучении ее роль в здоровье и болезни.
Несколько исследований были рассмотрены ФГО динамики и ее обмена с межклеточной жидкости (ISF) в паренхиме мозга. Однако, методы, которыми помечены молекулы доставляются довольно инвазивными, вызывая повреждение паренхимы мозга и изменения в внутричерепного давления (ИКП) (см. Обзор10). Некоторые примеры внутрижелудочкового или intraparenchymal инъекции, которые включают краниотомии или бурение Берр отверстие в черепе. Было показано, что эти процедуры изменить ПМС, тем самым нарушая glymphatic функция2. Кроме того такие инвазивные методы вызывают astrogliosis и увеличить иммунореактивности AQP-4 в районе повреждения паренхимы мозга и его окрестности11,12. Как астроциты и AQP-4 являются ключевыми элементами системы glymphatic, CMc является методом выбора для своих исследований. Основные преимущества CMc по сравнению с более инвазивных процедур являются поддержание нетронутыми паренхимы черепа и головного мозга, избегая ICP изменения и astrogliosis, соответственно. Таким образом CMc в сочетании с различными инструментами обработки изображений открывает широкий спектр возможностей для изучения не только glymphatic системы, но и динамику и механизмы потока жидкости в гомеостаза, а также в животных моделях неврологических заболеваний.
Чистерна magna катетеризации (CMc) процедура позволяет легко и прямой доступ к спинномозговой жидкости (СМЖ). Путем инъекций различных молекул (например люминесцентные Индикаторы, МРТ контрастного вещества) экспериментатора может отслеживать их движение в одном купе ФГО и оценить деятельность системы glymphatic. Следующий протокол описывает как острый CMc, для инъекций сразу после операции и хронические имплантации канюля, в которой животное оправится от хирургической процедуры для более поздних инъекций. Наиболее важное различие между острой и хронической имплантации, что хронические Имплантация позволяет для изучения деятельности glymphatic проснулся мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы представили протокол, который описывает подробные процедуры для катетеризации magna Чистерна (CMc), который предлагает простой способ доставить обозначенных молекул в отсеке CSF. CMc позволяет последующих визуализации динамики ФГО, как в естественных условиях , так и ex vivo, исполь?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ново Нордиск фонд и Национальный институт неврологических нарушений и инсульта, NINDS/низ (м.н.). A.L.R.X. и S.H-R являются получателями докторантура стипендий и PhD стипендии от фонда компании «Лундбек», соответственно.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
- Xie, L., et al. Sleep Drives Metabolite Clearance from the Adult Brain. Science. , 373-377 (2013).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci. Transl. Med. 4, 147ra111 (2012).
- Jessen, N. A., Munk, A. S. F., Lundgaard, I., Nedergaard, M. The Glymphatic System: A Beginner’s Guide. Neurochem. Res. 40, 2583-2599 (2015).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. , (2015).
- Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J. Exp. Med. 212, 991-999 (2015).
- Kress, B. T., et al. Impairment of paravascular clearance pathways in the aging brain. Ann. Neurol. 76, 845-861 (2014).
- Plog, B. A., et al. Biomarkers of Traumatic Injury Are Transported from Brain to Blood via the Glymphatic System. J. Neurosci. 35, 518-526 (2015).
- Jiang, Q., et al. Impairment of glymphatic system after diabetes. J. Cereb. Blood Flow Metab. , (2016).
- Peng, W., et al. Suppression of glymphatic fluid transport in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neurobiol. Dis. 93, 215-225 (2016).
- Orešković, D., Klarica, M. The formation of cerebrospinal fluid: Nearly a hundred years of interpretations and misinterpretations. Brain Res. Rev. 64, 241-262 (2010).
- Dusart, I., Schwab, M. E. Secondary Cell Death and the Inflammatory Reaction After Dorsal Hemisection of the Rat Spinal Cord. Eur. J. Neurosci. 6, 712-724 (1994).
- Eide, K., Eidsvaag, V. A., Nagelhus, E. A., Hansson, H. -. A. Cortical astrogliosis and increased perivascular aquaporin-4 in idiopathic intracranial hypertension. Brain Res. , (2016).
- Pullen, R. G., DePasquale, M., Cserr, H. F. Bulk flow of cerebrospinal fluid into brain in response to acute hyperosmolality. Am. J. Physiol. 253, F538-F545 (1987).
- Ichimura, T., Fraser, P. A., Cserr, H. F. Distribution of extracellular tracers in perivascular spaces of the rat brain. Brain Res. 545, 103-113 (1991).
- Iliff, J. J., et al. Brain-wide pathway for waste clearance captured by contrast-enhanced MRI. J. Clin. Invest. 123, 1299-1309 (2013).
- Ratner, V., et al. Optimal-mass-transfer-based estimation of glymphatic transport in living brain. Proc. SPIE–the Int. Soc. Opt. Eng. 9413, (2015).
- Lee, H., et al. The Effect of Body Posture on Brain Glymphatic Transport. J. Neurosci. 35, 11034-11044 (2015).
- Nouri, S., Sharif, M. R., Sahba, S. The effect of ferric chloride on superficial bleeding. Trauma Mon. 20, e18042 (2015).
