Impianto di cannula in Cisterna Magna di roditori
Summary
Qui descriviamo un protocollo per eseguire cisterna magna inserimento di una canula (CMc), un modo minimamente invasivo per offrire elementi traccianti, substrati e molecole di segnalazione nel liquido cerebrospinale (CSF). In combinazione con differenti modalità di imaging, CMc permette glifatico sistema e valutazione dinamica di CSF, come pure la consegna di tutto il cervello di vari composti.
Abstract
Incannulamento di cisterna magna (CMc) è una procedura semplice che consente di raggiungere direttamente il liquido cerebrospinale (CSF) senza danneggiamento operativo del cranio o del parenchima cerebrale. In roditori anestetizzati, l’esposizione del mater di dura di scollamento dei muscoli del collo permette l’inserimento di una cannula nella cisterna magna (CM). La cannula, composta da un ago smussato o borosilicato capillare, è collegata tramite un tubo di polietilene (PE) a una siringa. Utilizzando una pompa a siringa, molecole possono quindi essere iniettati al prezzo controllato direttamente in CM, che è in continuità con lo spazio subaracnoideo. Dallo spazio subaracnoideo, si rintracciano CSF flussi di flusso convettivo nello spazio perivascolare intorno penetrante arteriole, dove si verifica scambio di soluti con il fluido interstiziale (ISF). CMc può essere eseguita per iniezioni acute subito dopo l’intervento chirurgico, o per l’impianto cronico, con successiva iniezione in anestetizzato o sveglio, liberi di muoversi roditori. Quantificazione della distribuzione dell’elemento tracciante nel parenchima del cervello può essere eseguita da epifluorescenza, 2-fotone microscopia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI), a seconda delle proprietà fisico-chimiche delle molecole iniettate. Così, CMc in combinazione con varie tecniche di imaging offre un potente strumento per la valutazione del sistema di glifatico e dinamica di CSF e funzione. Inoltre, CMc può essere utilizzato come un canale per la consegna veloce, tutto il cervello di segnalazione molecole e substrati metabolici che non potrebbero altrimenti attraversare la barriera emato encefalica (BBB).
Introduction
Liquido cerebrospinale (CSF) bagna il sistema nervoso centrale (SNC) in tutto il sistema ventricolare e lungo gli spazi subaracnoidei, un spazio anatomicamente definito nel continuum con i ventricoli, che circonda il cervello e il midollo spinale. Una delle funzioni principali del QCS è quello di fornire un percorso per la liquidazione dei metaboliti e soluti dal parenchima del cervello. Liquidazione è facilitata tramite il glifatico recentemente scoperto sistema1, cervello analogico al sistema linfatico periferico. Qui, descriviamo e discutiamo la cisterna magna inserimento di una canula (CMc), un metodo come minimo dilagante per la consegna diretta di molecole nel CSF. CMc è il metodo principale per studiare la funzione di glifatico. Inoltre, CMc può essere applicato anche per lo studio della dinamica di CSF e per una consegna veloce, tutto il cervello di molecole permeabili di barriera (BBB) non-emato encefalica nel parenchima cerebrale, lungo lo spazio perivascolare.
La CMc sfrutta principi fisiologici di dinamiche di movimento di CSF attraverso snc di consegnare con etichetta tracer molecole o farmaci nello spazio pieno di CSF cisterna magna (CM). Molecole vengono iniettati attraverso una cannula impiantata nel covering dural membrana atlanto-occipital che le molecole CM. sono poi trasportate da flusso di massa di CSF nel parenchima cerebrale tramite il paravenosa spazio1. Agente tracciante o contrasto iniettato tramite la CMc segue il movimento del CSF, che permette la valutazione di movimento di CSF e glifatico afflusso di quantificare i livelli di intensità di molecole con etichettate che entrano il parenchima cerebrale. CMc è compatibile con diverse tecniche di formazione immagine compreso epifluorescenza, 2-fotone microscopia e la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI). Inoltre, tale valutazione può essere eseguita sia in vivo o ex vivo. D’importanza, CMc consente la visualizzazione del sistema glifatico sotto anestesia o durante il sonno naturale, così come negli animali svegli, liberamente commoventi.
La tecnica di CMc può essere utilizzata per studiare i diversi aspetti della dinamica dei fluidi nel CSF, ma ha dimostrato di essere particolarmente utile per studiare il sistema di glifatico. Glifatico attività aziona il flusso convettivo di CSF dallo spazio periarterial tramite canali d’acqua Acquaporina-4 (AQP-4), che sono legati nella membrana di astrocytic vascolare a capo endfeet. Il flusso convettivo permette l’interscambio di CSF e di liquido interstiziale (ISF) all’interno del parenchima cerebrale. CSF/ISF contenenti soluti e scorie metaboliche viene quindi rimosso dal parenchima cerebrale tramite il perivenous spazio2,3. In definitiva, CSF/ISF raggiunge la periferia attraverso i vasi linfatici dural recentemente descritto4,5. Il sistema di glifatico ha dimostrato cruciale per la liquidazione dei metaboliti nocivi dei rifiuti come amiloide-β2. Ulteriormente, glifatico liquidazione è compromessa nell’invecchiamento6, dopo la ferita di cervello traumatica7e in modelli animali di diabete8 e9di morbo di Alzheimer. In particolare, attività di glifatico è stato dipendente, mostrando attività significativamente più alto durante il sonno o anestesia in confronto a Veglia1. Infatti, giovani animali anestetizzati esibiscono il più alta attività di glifatico. Così, quantificazione sperimentale dell’attività di glifatico è fondamentale quando si studia il suo ruolo nella salute e nella malattia.
Diversi studi hanno affrontato dinamica di CSF e suo interscambio con liquido interstiziale (ISF) nel parenchima del cervello. Tuttavia, i metodi con cui vengono consegnati con etichettate molecole sono piuttosto invasivi, innescando il danno del parenchima cerebrale e variazioni della pressione intracranica (ICP) (vedere recensione10). Alcuni esempi sono intraventricolare o iniezioni di intraparenchymal che coinvolgono craniotomia o foratura di una bava con foro nel cranio. Queste procedure sono state indicate per alterare ICP, interrompendo così la glifatico funzione2. Inoltre, tali metodi invasivi inducono astrogliosi e aumentano il immunoreactivity AQP-4 nella zona di parenchima danneggiato del cervello e suoi dintorni11,12. Come astrociti e AQP-4 sono elementi chiave del sistema glifatico, il CMc è il metodo di scelta per i suoi studi. I principali vantaggi di CMc in confronto ad altre procedure invasive sono il mantenimento di un parenchima di cranio e cervello intatto, evitando alterazioni ICP e astrogliosis, rispettivamente. CMc in combinazione con diversi strumenti di imaging si apre così, per una vasta gamma di possibilità di studiare non solo il sistema di glifatico, ma anche le dinamiche e i meccanismi di flusso del fluido nell’omeostasi, così come nei modelli animali di malattie neurologiche.
La procedura di inserimento di una canula (CMc) cisterna magna permette un accesso facile e diretto per il liquido cerebrospinale (CSF). Iniettando diverse molecole (es. traccianti fluorescenti, agenti di contrasto MRI) lo sperimentatore può monitorare i loro movimenti all’interno del compartimento di CSF e valutare l’attività del sistema glifatico. Il seguente protocollo descrive entrambi la CMc acuta, per iniezioni immediatamente dopo la chirurgia e l’impianto cronico della cannula, in cui l’animale recupera dalla procedura chirurgica per una successiva iniezione. La differenza più importante tra l’impianto acuto e cronico è che l’impianto cronico permette lo studio dell’attività glifatico in topi svegli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo presentato un protocollo che descrive una procedura dettagliata per cisterna magna inserimento di una canula (CMc), che offre un metodo semplice per trasportare molecole con etichettate nel vano di CSF. CMc consente la visualizzazione successiva di dinamica di CSF, sia in vivo ed ex vivo, utilizzando diverse modalità di imaging o istologia.
Uno dei principali vantaggi della tecnica CMc si trova nel relativo accesso diretto allo spazio subaracnoideo senza la necessit?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalla Novo Nordisk Foundation e Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo, NINDS/NIH (M.N.). A.L.R.X. e Sangiorgio-R sono destinatari di una borsa di studio post-dottorato e una borsa di studio di dottorato di ricerca della Fondazione di Lundbeck, rispettivamente.
Materials
| SOPIRA Carpule 30G 0.3 x 12mm | Kulzer | AA001 | |
| Polyethylene Tubing 0.024” OD x 0.011” ID | Scandidact | PE10-CL-500 | |
| 30G x ½” 0.3 x 12 mm Luer-Lock | Chirana T. Injecta | CHINS01 | |
| Chlorhexidine 0.5% (chlorhexidine digluconate) | Meda AS | no catalogue number, see link in comments | http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/ |
| Alcohol Swab 70% Isopropyl Alcohol 30 x 60mm | Vitrex Medical A/S | 520213 | |
| Viskoese Oejendraeber Ophtha | Ophtha | 145250 | |
| Wooden applicator, Double cotton bud (Ø appr. 4 – 5 mm, length appr. 12 mm) | Heinz Herenz | 1032018 | |
| Eye spears | Medicom | A18005 | |
| Ferric chloride 10% solution | Algeos | NV0382 | |
| Kimtech Science Precision Wipes Tissue Wipers | Kimberly Clark Professional | 05511 | |
| Loctite Super Glue Precision 5g | Loctite | no catalogue number, see link in comments | http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html |
| Insta-Set CA Accelerator | Bob Smith Industries | BSI-152 | |
| Dental Cement Powder | A-M Systems | 525000 | |
| Surgical weld | Kent Scientific Corporation | INS750391 | |
| Hamilton syringe GASTIGHT® , 1700 series, 1710TLL, volume 100 μL, PTFE Luer lock | Hamilton syringes | 1710TLL | |
| LEGATO 130 Syringe pump | KD Scientific | 788130 | |
| Paraformaldehyde powder, 95% | Sigma Aldrich | 158127 | |
| Phosphate buffered saline (PBS; 0.01M; pH 7.4) | Sigma Aldrich | P3813 | |
| Ovalbumin, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | O34784 | |
DAPI (diamidino-2-phenylindole) Solution (1 mg/mL) |
Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| Dextran, Fluorescein, 3000 MW, Anionic | Thermo Fisher Scientific | D3305 | |
| E-Z Anesthesia EZ-7000 Classic System | E-Z Systems | EZ-7000 | |
| Attane Isofluran 1000 mg/g | ScanVet | 55226 | |
| Euthanimal 200mg/mL (sodium pentobarbital) | ScanVet | 545349 | |
| Ketaminol Vet 100 mg/mL (ketamine) | Intervet International BV | 511519 | |
| Rompin Vet 20 mg/mL (xylazin) | KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH | 148999 | |
| Xylocain 20 mg/mL (lidocain) | AstraZeneca | 158543 | |
| Marcain 2.5 mg/mL (bupivacain) | AstraZeneca | 123918 | |
| Bupaq Vet 0.3 mg/mL (buprenorphine) | Richter Pharma AG | 185159 |
References
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