Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación
Summary
Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.
Abstract
La respuesta de daño de DNA (DDR) utiliza una gran cantidad de proteínas para detectar la señal y reparar las lesiones del ADN. Delineación de esta respuesta es fundamental para entender los mecanismos de mantenimiento del genoma. Puesto que el reclutamiento y el intercambio de proteínas en las lesiones son altamente dinámicos, su estudio requiere la capacidad para generar daños en el ADN de una manera rápida y espacialmente delimitado. Aquí, describimos los procedimientos para inducir localmente el daño de la DNA en células humanas usando un microscopio confocal escaneo láser comúnmente disponible equipado con una línea de láser de 405 nm. Acumulación de mantenimiento genoma factores en rayas de láser pueden evaluarse por inmunofluorescencia (IF) o en tiempo real utilizando proteínas etiquetadas con reporteros fluorescentes. Utilizando fosforiladas histonas H2A. X (γ-H2A.X) y replicación de proteína A (RPA) como marcadores, el método proporciona suficiente resolución para discriminar factores contratados localmente que difunda en cromatina adyacente. Además proporcionamos scripts basados en ImageJ para controlar eficientemente la cinética de la relocalización de la proteína al ADN dañan sitios. Estos refinamientos simplifican enormemente el estudio de la dinámica de la DDR.
Introduction
Las células están constantemente expuestas a las fuentes endógenas y exógenas de daño en el ADN que amenazan su integridad genómica. El DDR es un conjunto de vías que detectan, señalan y reparacion las lesiones del ADN para mantener la estabilidad del genoma de señalización. En roturas de doble hebra de DNA (distritales), lo DDR se produce principalmente en dos plataformas complementarias: γ-H2A.X-labeled cromatina y una región de ADN (ssDNA) monocatenario resecada normalmente recubierta de ssDNA-enlace complejo EPR1,2.
UV-láser micro-irradiación de células sensibilizadas previamente con la timidina analógica 5-bromo-2′ desoxiuridina (BrdU) o el tinte de ADN bisbenzimide etóxido trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) crea una mezcla de lesiones de ADN, como roturas de cadena simple ( SSBs) y distritales que provocan una DDR localizada en la cromatina y el ssDNA plataformas3,4. Trabajos previos demostraron que reclutamiento de factores de mantenimiento del genoma para estas dos plataformas distintas en el OSD puede ser discriminado con láseres de alta energía UV-A (335-365 nm) combinados con IF2,5. Microscopios equipados con estos láseres son costosos ya que requieren un láser de alta energía y dedicados objetivos de transmisión UV-A haciéndolos mucho menos frecuente en contextos académicos y farmacéuticos que microscopios confocales de escaneo láser con láser de 405 nm líneas. El estudio de reclutamiento de la proteína y el intercambio en los sitios de micro-irradiado también queda excluido por el análisis de imagen manual laborioso requerido para describir el comportamiento dinámico de los factores de mantenimiento del genoma.
Aquí, mostramos que la sensibilización previa de las células con tinción de ácido nucleico BrdU o BBET seguida de irradiación de micro usando una 405 nm láser a un microscopio confocal común permite el monitoreo de la dinámica de factor de mantenimiento de genoma en las lesiones del ADN. Γ-H2A.X o subunidades complejo de RPA como marcadores de la plataforma junto con z de apilamiento para mayor profundidad de campo y deconvolución resolución permite al experimentador discriminar los factores que son reclutados localmente a distritales a las que se extendió a Dominios de cromatina grande que rodea la lesión inicial. Esta sub-clasificación según distintos compartimentos intra nucleares ayuda a perfeccionar los roles potenciales de desacostumbrada proteínas reclutadas a sitios irradiados de micro. Además, ofrecemos protocolos convenientes y optimizado tuberías para analizar rápidamente la dinámica de los factores de mantenimiento del genoma usando el software de código abierto Fiji (una distribución de ImageJ)6,7,8. Estos refinamientos a los métodos de micro-irradiación actuales hacen el estudio de la DDR posible en prácticamente cualquier entorno de laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizando los métodos mencionados anteriormente, 405 nm láser micro-irradiación de células sensibilizadas previamente con BBET o BrdU permite la generación localizada de las lesiones del ADN incluyendo distritales dentro de los núcleos de las células humanas adherentes. Cinética de DDR en estos distritales son similares a los generados con otros métodos en las células eucariotas9,18,19. Resección de DSB en sitios irr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá [descubrimiento subsidio 5026 h] y por una nueva generación de científicos de la sociedad de investigación del cáncer [21531 a A.M]. Agradecemos a Jean-François Lucier para proporcionar control de calidad excelente de los scripts de Python de Fiji y asesoramiento en análisis estadístico. Damos las gracias por la receta de solución de fijación IF Dr. Stephanie A. Yazinski. Agradecemos a Paul Ludovic Karsenti ayuda con medidas de potencia láser.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
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