Indagine di assunzione di proteine per lesioni del DNA utilizzando 405 Nm Laser Micro-irradiazione
Summary
Studiare la cinetica di riparazione danni del DNA richiede un sistema di indurre lesioni alle regioni definite sub-nucleare. Descriviamo un metodo per creare interruzioni di double-stranded localizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser, dotato di un laser di 405 nm e forniscono procedure automatizzate per quantificare la dinamica di fattori di riparazione a queste lesioni.
Abstract
La risposta di danno del DNA (DDR) utilizza una pletora di proteine per rilevare, segnalare e riparare le lesioni del DNA. Delineazione di questa risposta è fondamentale per capire i meccanismi di manutenzione del genoma. Dal momento che il reclutamento e lo scambio di proteine alle lesioni sono altamente dinamici, il loro studio richiede la capacità di generare danni al DNA in maniera rapida e spazialmente delimitato. Qui, descriviamo le procedure per indurre localmente il danno del DNA in cellule umane utilizzando un microscopio confocale laser-scanner comunemente disponibile dotato di una linea di laser 405 nm. Accumulo di manutenzione genoma fattori alle strisce di laser possono essere valutati mediante immunofluorescenza (IF) o in tempo reale utilizzando proteine etichettati come reporter fluorescenti. Utilizzando fosforilato istone H2A. X (γ-H2A.X) e Replication Protein A (RPA) come marcatori, il metodo fornisce una risoluzione sufficiente per discriminare fattori reclutati da coloro che si sono diffuse sulla cromatina adiacente. Forniamo ulteriori script basati su ImageJ per monitorare in modo efficiente la cinetica di rilocalizzazione della proteina al DNA danni siti. Questi perfezionamenti semplificano notevolmente lo studio della dinamica della DDR.
Introduction
Le cellule sono costantemente esposti a fonti endogene ed esogene di danno del DNA che minacciano l’integrità genomica. Il DDR è un insieme di vie che rilevare, segnalare e ripristino le lesioni del DNA per sostenere la stabilità del genoma di segnalazione. Alle rotture del doppio filamento del DNA (DSBs), la DDR si verifica principalmente su due piattaforme complementari: γ-H2A.X-labeled cromatina e una regione di DNA (ssDNA) single-stranded resecata in genere rivestito con il ssDNA-associazione complessa RPA1,2.
Micro-irradiazione UV-laser delle cellule pre-sensibilizzate con la timidina analogica 5-bromo-2′ deoxyuridine (BrdU) o la tintura di DNA bisbenzimide etossido triidrocloruro (Giordano, Hoechst 33342) crea una miscela di lesioni del DNA tra cui rotture del singolo filamento ( SSB) e DSBs che suscitare un DDR localizzato sulla cromatina sia ssDNA piattaforme3,4. Lavori precedenti hanno mostrato che il reclutamento di fattori di mantenimento del genoma per queste due piattaforme distinte al DSB può essere discriminata utilizzando laser a raggi UV-A ad alta energia (335-365 nm) combinato con se2,5. Microscopi dotati di tali laser sono costosi, in quanto richiedono un laser ad alta energia e obiettivi trasmettenti dedicati di UV-A che li rende molto meno prevalente in contesti accademici e farmaceutici che microscopi confocale a scansione laser con laser 405 nm linee. Lo studio di assunzione di proteine e di scambio in siti di micro-irradiati è interdetto anche dall’analisi manuale laborioso dell’immagine necessario per descrivere il comportamento dinamico di fattori di mantenimento del genoma.
Qui, indichiamo che il pre-sensibilizzazione delle cellule con BrdU o Giordano acido nucleico macchia seguita da micro-irradiazione con un laser di 405 nm su un comune microscopio confocale permette il monitoraggio delle dinamiche di fattore di manutenzione genoma a lesioni del DNA. L’utilizzo di γ-H2A.X o subunità complessa RPA come marcatori di piattaforma insieme a z-stacking per una maggiore profondità di campo e deconvoluzione per una migliore risoluzione consente lo sperimentatore di discriminare i fattori che sono reclutati localmente a DSBs da quelle che si diffondono a domini di cromatina grande che circonda la lesione iniziale. Questa sub-classificazione secondo distinti compartimenti intra-nucleare aiuta a perfezionare i potenziali ruoli delle proteine atipici reclutati ai siti di micro-irradiati. Inoltre, forniamo conveniente protocolli e ottimizzato condutture per analizzare rapidamente la dinamica dei fattori di mantenimento del genoma utilizzando il software open-source Fiji (una distribuzione ImageJ)6,7,8. Questi perfezionamenti per gli attuali metodi di micro-irradiazione rendono lo studio della DDR possibile in praticamente qualsiasi ambiente di laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando i metodi descritti sopra, 405 nm laser micro-irradiazione delle cellule pre-sensibilizzate con Giordano o BrdU consente la generazione localizzata delle lesioni del DNA compreso DSBs all’interno dei nuclei delle cellule umane aderenti. Cinetica della DDR a questi DSBs sono simili a quelli generati con altri metodi in cellule eucariotiche9,18,19. Resezione di DSB presso siti di micro-irradiati conduce a ssDNA-generazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada [Discovery sovvenzione 5026 Agresta] e da una nuova generazione di scienziati di borsa di studio dalla società di ricerca cancro [21531 per Agresta]. Ringraziamo Jean-François Lucier per fornire il controllo di qualità eccellente degli script Python Fiji e consulenza sull’analisi statistica. Ringraziamo il Dr. Stephanie A. Yazinski per la ricetta di soluzione di fissazione se. Ringraziamo Paul-Ludovic Karsenti per aiuto con le misurazioni di potenza laser.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
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