Расследование белка вербовки для поражения ДНК с помощью 405 нм лазер микро облучения
Summary
Изучение кинетики ремонт повреждений ДНК требует системы побудить поражений в определенных регионах югу ядерного. Мы описываем метод для создания локализованных двуцепочечные разрывы, с помощью лазерного сканирования Конфокальный микроскоп оснащен 405 нм лазер и автоматизированных процедур для количественного определения динамики ремонт факторов на этих поражений.
Abstract
Ответ повреждения ДНК (РДР) использует множество белков для обнаружения, сигнал и ремонт повреждений ДНК. Разграничения этот ответ имеет решающее значение для понимания механизмов обслуживания генома. Так как набора и обмен белков в поражения высокой динамичностью, их исследование требует способность генерировать повреждения ДНК в основе быстрого и пространственно запятыми. Здесь мы описываем процедуры локально вызвать повреждения ДНК в клетках человеческого организма с помощью обычно доступных лазерное сканирование Конфокальный микроскоп оборудованы с линией лазера 405 нм. Накопление генома обслуживания, которую можно оценить факторы, лазерным полосы иммунофлюоресценции (IF) или в режиме реального времени с помощью белков, отмеченных флуоресцентные журналистам. Использование фосфорилированных гистона Н2А. X (γ-H2A.X) и репликации белка (РПА) как маркеры, метод обеспечивает достаточное разрешение подвергать набранных факторы от тех, которые распространяются на соседние хроматина. Мы далее предлагаем ImageJ скриптам эффективно контролировать кинетика relocalization белка в ДНК повреждения сайтов. Эти усовершенствования значительно упростить изучение динамики DDR.
Introduction
Клетки постоянно подвергаются эндогенных и экзогенных источники повреждения ДНК, которые угрожают их геномной целостности. DDR-ансамбль сигнальные пути, которые обнаружить, сигнал и ремонт повреждений ДНК для поддержания стабильности генома. В разрывы двуцепочечной ДНК (DSBs), РДР происходит главным образом на двух взаимодополняющих платформ: γ-H2A.X-меченых хроматина и резекции одноцепочечной ДНК (ssDNA) регион обычно покрытием с1,комплекс РПА ssDNA binding,2.
УФ лазер микро облучения клеток, предварительно сенсибилизированных с тимидина аналоговых 5-бром-2′ дезоксиуридина (BrdU) или trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) ДНК bisbenzimide ethoxide краска создает смесь поражения ДНК одноцепочечной перерывы (включая Рабочего тормоза РСРТ) и DSBs, которые вызывают локализованных DDR на хроматина и ssDNA платформ3,4. Предыдущие работы показал, что набор факторов поддержания генома для этих двух различных платформ в ДГЖД могут подвергаться с использованием высокой энергии UV-A лазеров (335-365 Нм) в сочетании с если2,5. Микроскопы, оборудованы такие лазеры являются дорогостоящим, поскольку они требуют высокой энергии лазера и посвященный UV-A передачи целей делает их гораздо менее распространены в научных и фармацевтических параметров, чем сканирование лазерного конфокального микроскопов с 405 нм лазер линии. Исследование протеина набора и обмен на микро облучении сайтов также исключается путем анализа трудоемкий ручной изображения, необходимые для описания динамического поведения факторов поддержания генома.
Здесь мы покажем, что предварительное информирование клеток с BrdU или BBET пятен нуклеиновой кислоты после микро облучения с помощью 405 нм лазер на общей Конфокальный микроскоп позволяет осуществлять мониторинг динамики фактор поддержания генома в ДНК повреждения. Γ-H2A.X или комплекс подразделений пар как маркеры платформы вместе с z укладка для большей глубины резкости и деконволюция для улучшения разрешения позволяет экспериментатор различать факторы, которые набираются на местной DSBs от тех, которые распространяются на большие хроматина домены вокруг первоначального очага поражения. Этот подпункт классификация отдельных отсеков внутри ядерной помогает уточнить потенциальной роли uncharacterized белков, набранных для микро облучении сайтов. Кроме того мы предоставляем удобный протоколы и оптимизированы трубопроводов быстро анализировать динамику факторов поддержания генома используя программное обеспечение open-source Фиджи (распределение ImageJ)6,7,8. Эти уточнения нынешних методов микро облучения оказывают исследования РДР можно практически в любых условиях лаборатории.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя методы, описанные выше, 405 нм лазер микро облучения клеток, предварительно сенсибилизированных с BBET или BrdU позволяет локализованные поколение поражения ДНК, включая DSBs в ядрах адэрентных клеток человека. Кинетика процесса РДР в этих DSBs аналогичны с другими методами в эукарио?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержку естественных наук и инженерных исследований Совет Канады [открытие Грант 5026 A.M] и следующего поколения ученых стипендию от общества исследований рака [21531 до A.M]. Мы благодарим Жан-Франсуа Люсьера за отличные качества Фиджи Python скриптов и советы по статистического анализа. Мы благодарим д-р Стефани а. Yazinski за рецепт решения если фиксации. Мы благодарим Пол-Людовик Karsenti за помощь с измерения мощности лазера.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
