Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung
Summary
DNA-Schäden reparieren Kinetik Studium erfordert ein System zur Läsionen an definierte Sub-atomaren Regionen zu induzieren. Wir beschreiben eine Methode zum Erstellen von lokalisierter Doppelstrang-Pausen mit einem konfokale Laserscanning-Mikroskop ausgestattet mit einem 405 nm-Laser und bieten automatisierte Verfahren zur Quantifizierung der Dynamik der Reparatur Faktoren bei dieser Läsionen.
Abstract
Die DNA-Schäden als Reaktion (DDR) verwendet eine Vielzahl von Proteinen zu erkennen, zu signalisieren und DNA-Läsionen zu reparieren. Abgrenzung dieser Reaktion ist entscheidend für die Genom-Wartung-Mechanismen zu verstehen. Da Rekrutierung und Austausch von Proteinen bei Läsionen sehr dynamisch sind, erfordert ihre Studie die Fähigkeit, DNA-Schäden schnell und räumlich abgegrenzt zu generieren. Hier beschreiben wir Verfahren zur DNA-Schäden in den menschlichen Zellen mit einem handelsüblichen Laserscanning-konfokale-Mikroskop verfügt über eine 405 nm Laserlinie lokal zu induzieren. Ansammlung von Genom-Wartung, die Faktoren bei Laser Streifen durch Immunfluoreszenz (IF) oder in Echtzeit bewertet werden können mittels Proteine mit fluoreszierenden Reporter verschlagwortet. Verwendung von phosphorylierten Histon H2A. X (γ-H2A.X) und Replikation Protein A (RPA) als Marker, die Methode bietet ausreichenden Auflösung lokal rekrutiert Faktoren von denen zu unterscheiden, die auf angrenzenden Chromatin verteilt. Wir bieten weitere ImageJ-basierte Skripts effizient überwachen die Kinetik der Protein Relokalisierung DNA Websites beschädigen. Diese Verfeinerungen erleichtern erheblich die Studie der DDR Dynamik.
Introduction
Zellen sind ständig endogenen und exogenen Quellen von DNA-Schäden ausgesetzt, die ihre genomischen Unversehrtheit bedrohen. Die DDR ist ein Ensemble der Signalwege, die erkennen, zu signalisieren und zu reparieren DNA-Läsionen um Genomstabilität aufrecht zu erhalten. Im DNA-Doppelstrang-Brüchen (DSB), tritt die DDR hauptsächlich auf zwei komplementäre Plattformen: γ-H2A.X-mit der Bezeichnung Chromatin und einer resezierten einzelsträngiger DNA (SsDNA) Region in der Regel mit dem SsDNA-Bindung komplexe RPA1,2beschichtet.
UV-Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen, die bereits mit dem Thymidin analoge 5-Bromo-2′ Deoxyuridine (BrdU) oder der Bisbenzimide Ethoxide Trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA-Farbstoff sensibilisiert schafft eine Mischung aus einsträngiger Pausen (einschließlich DNA-Läsionen SSBs) und DSB, die eine lokalisierte DDR auf das Chromatin und SsDNA Plattformen3,4zu entlocken. Vorherigen Arbeiten zeigten, dass die Rekrutierung von Genom Wartungsfaktoren, diese zwei unterschiedlichen Plattformen auf DSB mit hochenergetischen UV-A-Lasern (335-365 nm) kombiniert mit IF2,5diskriminiert werden kann. Mikroskope mit solchen Lasern ausgestattet sind teuer, da sie ein Hochenergie-Laser und spezielle UV-A Übertragung Ziele damit weit weniger verbreitet in akademischen und pharmazeutischen Einstellungen als Laserscanning-konfokale Mikroskope mit 405 nm Laser erfordern Linien. Die Untersuchung von Protein-Rekrutierung und Austausch an Mikro-bestrahlten Standorten ist auch durch die mühsame manuelle Bildanalyse erforderlich, um das dynamische Verhalten des Genoms Wartungsfaktoren beschreiben ausgeschlossen.
Hier zeigen wir, dass die Pre-Sensibilisierung der Zellen mit BrdU oder BBET Nukleinsäure-Fleck gefolgt von Mikro-Bestrahlung mit einem 405 nm-Laser auf eine gemeinsame confocal Mikroskop ermöglicht die Überwachung des Genoms Wartung Faktor Dynamik bei DNA-Läsionen. Mit γ-H2A.X oder RPA komplexe Untereinheiten als Plattform Marker zusammen mit Z-Stapeln für größere Schärfentiefe und Dekonvolution für verbesserte Auflösung ermöglicht den Experimentator, Faktoren zu unterscheiden, die lokal zu DSB von denen geworben werden, die zu verbreiten großen Chromatin Domains rund um die ersten Läsion. Diese Untergliederungen nach unterschiedlichen Intra nuklearen Fächer hilft die möglichen Rollen des Fußgelenkes Proteine rekrutiert zu Mikro-bestrahlt Websites zu verfeinern. Wir bieten bequeme Protokolle und optimiert Rohrleitungen um die Dynamik des Genoms Wartungsfaktoren mit Open-Source-Software Fidschi (eine ImageJ-Verteilung)6,7,8schnell zu analysieren. Diese Verfeinerungen zu aktuellen Mikro-Bestrahlung Methoden ermöglichen die Studie der DDR in praktisch jedem Labor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verwenden die oben beschriebenen Methoden, ermöglicht 405 nm Laser Mikro-Bestrahlung von Zellen mit BBET oder BrdU bereits sensibilisiert die lokalisierte Erzeugung von DNA-Läsionen einschließlich der DSB in den Kernen der anhaftende menschliche Zellen. Kinetik der DDR bei diesen DSB ähneln denen generiert mit anderen Methoden in eukaryotischen Zellen9,18,19. DSB-Resektion an Mikro-bestrahlten Standorten führt zu SsDNA-Gene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada [Discovery Grant 5026 bis Uhr] und eine nächste Generation von Wissenschaftlern Stipendium von der Cancer Research Society [21531 bis Uhr] unterstützt. Wir danken Jean-François Lucier bietet hervorragende Qualitätskontrolle der Fidschi-Python-Skripten und Ratschläge zur statistischen Analyse. Wir danken Dr. Stephanie A. Yazinski für IF Fixierung Lösung Rezept. Wir danken Paul-Ludovic Karsenti für Hilfe bei Lasermessungen macht.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
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