חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה
Summary
לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.
Abstract
התגובה נזק דנ א (DDR) משתמש שפע של חלבונים כדי לזהות אות, תיקון ה-DNA נגעים. בהתוויית תגובה זו הוא קריטי להבין מנגנונים תחזוקה הגנום. מאז הגיוס ו- exchange של חלבונים-נגעים דינמי מאוד, המחקר שלהם דורש את היכולת להפיק DNA נזק באופן מהיר ולא מופרד במרחב. כאן, אנו מתארים הליכים באופן מקומי לגרום נזק לדנ א בתאים אנושיים באמצעות זמין נפוץ סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד עם קו 405 ננומטר לייזר. הצטברות של תחזוקה הגנום גורמים-פסים לייזר יכול להיות מוערך על-ידי immunofluorescence (אם) או בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויג עם כתבים פלורסנט. שימוש phosphorylated היסטון H2A. X (γ-H2A.X) שכפול חלבון A (RPA) כסמני, השיטה מספקת רזולוציה מספיק להפלות גורמים גייס באופן מקומי מאלה שהתפשט על כרומטין סמוכים. אנו מספקים עוד קבצי script מבוססי ImageJ לפקח ביעילות את קינטיקה של חלבון relocalization ב DNA נזק לאתרים. אלה ליטושים מפשטות מאוד חקר הדינמיקות DDR.
Introduction
התאים חשופים ללא הרף אנדוגני אקסוגני ומקורות של נזק לדנ א המאיימים על תקינותם גנומית. DDR הוא הרכב של איתות המסלולים לזהות, אות, ולאחר תיקון ה-DNA נגעים לקיים יציבות הגנום. ב- DNA גדילי כפול מעברי (DSBs), DDR מתרחשת בעיקר על שתי פלטפורמות משלימות: כרומטין γ-H2A.X-שכותרתו ‘, אזור resected חד גדילי הדנ א (ssDNA) בדרך כלל מצופה ssDNA מחייב מורכבים RPA1,2.
UV-לייזר מיקרו-הקרנה של תאים טרום רגיש עם תימידין אנלוגי 5-ברומו-2′ deoxyuridine (BrdU) או לצבוע דנ א bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) יוצר תערובת של נגעים דנ א חד גדילי מעברי (כולל SSBs) ו- DSBs אשר להפיק DDR המותאמות לשפות אחרות של כרומטין והן ssDNA פלטפורמות3,4. העבודות הקודמות הראה כי גיוס של הגנום גורמים תחזוקה פלטפורמות אלו ברורים שני ב DSB ניתן שיפלו תוך שימוש באנרגיה גבוהה UV-A לייזרים (335-365 ננומטר) בשילוב עם אם2,5. מיקרוסקופים מצויד עם לייזרים כאלה יקרות כפי שהם דורשים לייזר באנרגיה גבוהה, ייעודי קרינת UV-A להעברת ויעדים שהופך אותם הרבה פחות נפוצות בהגדרות האקדמית ובתחום הרוקחות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר עם 405 ננומטר לייזר קווים. המחקר של גיוס חלבון ו- exchange באתרים מוקרן מיקרו היא גם מנעה ידי ניתוח התמונה ידני מייגע נדרש לתאר את התנהגות דינמית של הגנום גורמים תחזוקה.
כאן, אנו מראים רגישות עולה מראש של תאים עם הכתם חומצת גרעין BrdU או BBET עקב באמצעות מיקרו-הקרנה 405 ננומטר לייזר במיקרוסקופ קונפוקלי משותף מאפשר בקרה של הגנום תחזוקה גורם דינמיקה ב DNA נגעים. שימוש γ-H2A.X או RPA subunits מורכבים סמני פלטפורמה יחד עם z-לערום יותר עומק השדה ואת deconvolution עבור רזולוציה משופרת מאפשר הנסיין להפלות גורמים אשר מגויסים באופן מקומי כדי DSBs מאלה להתפשט תחומים כרומטין גדולים סביב הנגע הראשוני. זו המשנה סיווג על פי מדורים אינטרה-גרעיני ברורים עוזר לחדד את התפקידים פוטנציאלי של חלבונים uncharacterized גייס לאתרים מוקרן-מיקרו. יתר על כן, אנו מספקים פרוטוקולים נוח, אופטימיזציה צינורות לנתח במהירות את הדינמיקה של הגנום גורמים תחזוקה באמצעות7,86,פיג’י (חלוקה ImageJ) תוכנת קוד פתוח. אלה ליטושים לשיטות מיקרו-הקרנה הנוכחי לדקלם את המחקר של DDR אפשרי כמעט בכל סביבה מעבדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות השיטות שפורטו לעיל, 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה של תאים טרום רגיש עם BBET או BrdU מאפשר הדור המותאמות לשפות אחרות של נגעים DNA לרבות DSBs בתחום הגרעינים של תאים אנושיים חסיד. קינטיקה של DDR-DSBs אלה דומים לאלה שנוצר עם שיטות אחרות התאים האיקריוטים9,18,<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה [גילוי מענק 5026 התעוררנו] ועל ידי של הדור הבא של מדענים מלגה מן האגודה לחקר סרטן [21531 כדי לפנות בוקר. השכל]. אנו מודים ז’אן פרנסואה Lucier על מתן בקרת איכות מעולה של סקריפטים פיתון פיג’י, עצות על ניתוח סטטיסטי. אנו מודים ד ר סטפני א Yazinski על המתכון פתרון אם קיבוע. אנו מודים פול-לודוויק Karsenti על העזרה עם מדידות חשמל לייזר.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
