Undersøgelse af Protein rekruttering til DNA læsioner ved hjælp af 405 Nm Laser mikro-bestråling
Summary
At studere DNA skader reparation kinetik kræver et system til at fremkalde læsioner på definerede sub nukleare regioner. Vi beskriver en metode til at oprette lokaliserede dobbelt-strenget pauser ved hjælp af en laser-scanning Konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser og give automatiserede procedurer for at kvantificere dynamikken i reparation faktorer på disse læsioner.
Abstract
DNA skader svar (DDR) bruger en overflod af proteiner til at registrere, signal og reparere DNA læsioner. Afgrænse denne reaktion er afgørende for at forstå genom vedligeholdelse mekanismer. Da rekruttering og udvekslingen af proteiner på læsioner er meget dynamisk, kræver deres undersøgelse evnen til at generere DNA-skader på en hurtig og rumligt afgrænset måde. Her, beskrive vi procedurer for lokalt inducerer DNA-skader i humane celler ved hjælp af et almindeligt tilgængelige laser-scanning Konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser linje. Ophobning af genom vedligeholdelse faktorer på laser striber kan vurderes ved immunofluorescens (IF) eller i realtid ved hjælp af proteiner markeret med fluorescerende journalister. Ved hjælp af fosforyleres Histon H2A. X (γ-H2A.X) og replikering Protein A (RPA) som markører, metoden giver nok opløsning til at diskriminere lokalt ansat faktorer fra dem, der spredes på tilstødende kromatin. Vi leverer yderligere ImageJ-baserede scripts til effektivt overvåge kinetik af protein relocalization i DNA skade websteder. Disse justeringer i høj grad forenkle studiet af DDR-dynamics.
Introduction
Celler er konstant udsat for endogene og eksogene kilder af DNA-skader, der truer deres genomisk integritet. DDR er et ensemble af signalering veje, der registrerer, signal og reparere DNA læsioner for at opretholde genom stabilitet. På DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs), DDR sker hovedsageligt på to komplementære platforme: γ-H2A.X-mærket kromatin og en resektion enkeltstrenget DNA (ssDNA) region typisk belagt med ssDNA-bindende kompleks RPA1,2.
UV-laser mikro-bestråling af celler pre sensibiliseret med thymidine analoge 5-bromo-2′ deoxyuridine (BrdU) eller bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA farve skaber en blanding af DNA læsioner herunder enkelt-strenget pauser ( SSBs) og DSBs, som fremkalder en lokaliseret DDR på både kromatin og ssDNA platforme3,4. Tidligere arbejde viste, at rekruttering af genom vedligeholdelse faktorer til disse to forskellige platforme på DSB kan blive udsat for ved hjælp af høj energi UV-A lasere (335-365 nm) kombineret med IF2,5. Mikroskoper udstyret med disse lasere er dyre, da de kræver en høj energi laser og dedikeret UV-A fremsendende målene gør dem langt mindre udbredt i akademiske og farmaceutiske indstillinger end laser-scanning Konfokal mikroskoper med 405 nm laser linjer. Studiet af protein rekruttering og udvekslingen på mikro-bestrålet websteder er også udelukket af den besværlige manuelle billedanalyse forpligtet til at beskrive den dynamiske opførsel af genom vedligeholdelse faktorer.
Vi viser her, at før sensibilisering af celler med BrdU eller BBET nukleinsyre pletten efterfulgt af mikro-bestråling ved hjælp af en 405 nm laser på et fælles Konfokal mikroskop giver mulighed for overvågning af genom vedligeholdelse faktor dynamics på DNA læsioner. Ved hjælp af γ-H2A.X eller RPA komplekse underenheder som platform markører sammen med z-stacking til større dybdeskarphed og deconvolution for forbedret opløsning tillader eksperimentatoren at diskriminere faktorer, der rekrutteres lokalt til DSBs fra dem, der breder sig til store kromatin domæner omkring den oprindelige læsion. Denne sub klassificering i henhold til særskilte intra nukleare rum hjælper med at forfine de potentielle roller af uncharacterized proteiner rekrutteret til mikro-bestrålet websteder. Desuden, vi leverer praktisk protokoller og optimeret rørledninger for hurtigt at analysere dynamikken i genom vedligeholdelse faktorer ved hjælp af open source software Fiji (en ImageJ distribution)6,7,8. Disse justeringer til nuværende mikro-bestråling metoder flyveregler studiet af DDR i stort set ethvert laboratorium indstilling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjælp af de metoder, der er skitseret ovenfor, tillader 405 nm laser mikro-bestråling af celler pre sensibiliseret med BBET eller BrdU den lokaliserede generation af DNA læsioner herunder DSBs inden for kerner af vedhængende humane celler. Kinetik af DDR på disse DSBs er lig dem genereret med andre metoder i eukaryote celler9,18,19. DSB resektion på mikro-bestrålet websteder fører til ssDNA-generation, som kan følge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [Discovery grant 5026 til A.M] og af en næste Generation af forskere stipendium fra Cancer Research Society [21531 til A.M]. Vi takke Jean-François Lucier for at levere fremragende kvalitetskontrol af Fiji Python scripts og rådgivning på statistisk analyse. Vi takker Dr. Stephanie A. Yazinski for hvis fiksering løsning opskrift. Vi takke Paul-Ludovic Karsenti for hjælp med laser power målinger.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
References
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
- Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
- Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
- Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
- Microirradiation Analysis Fiji Plugin. Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
- Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
- Dubois, J. -. C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
- Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
- Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
- Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
- Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
- Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
- Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68 (2009).
- Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
- Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
- Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
- Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).
