Summary
والهدف من هذا البروتوكول بالتحديد الكمي لإصلاح كروسلينكس الحمض النووي-البروتين محددة على بلازميد الحمض النووي. هي transfected lesioned البلازميدات في خطوط خلايا الثدييات المتلقية والوزن الجزيئي المنخفض تحصد في وقت متعددة النقاط تعداء بعد. حركية إصلاح الحمض النووي كمياً استخدام ملحق التمهيدي حبلا محددة يتبعها qPCR.
Abstract
والغرض من هذا الأسلوب لتوفير تقنية مرنة وسريعة، والكمية لدراسة الحركية إصلاح الحمض النووي-البروتين التشعب (DPC) في خطوط خلايا الثدييات. بدلاً من المعايرة على الصعيد العالمي إزالة لإزالة DPC الكروموسومات المستحثة إكسينوبيوتيك أو عفوية، يبحث هذا الفحص إصلاح الآفة متجانسة، محددة كيميائيا عرض التحديد في موقع واحد داخل الركازة بلازميد الحمض النووي. الأهم من ذلك، أن هذا النهج يتجنب استخدام المواد المشعة ولا تعتمد على التكنولوجيا باهظة الثمن أو درجة عالية من التخصص. بدلاً من ذلك، أنها تعتمد على الإجراءات القياسية الحمض النووي المؤتلف والأجهزة سلسلة من ردود الفعل (qPCR) بوليميراز في الوقت الحقيقي، والكمية المتاحة على نطاق واسع. نظراً للمرونة الملازمة للاستراتيجية المستخدمة، وحجم البروتين كروسلينكيد، وكذلك طبيعة الروابط الكيميائية والحمض النووي دقيقة يمكن أن تختلف تسلسل سياق موقع مرفق لمعالجة مساهمات هذه معلمات للكفاءة الكلية لإصلاح DPC. باستخدام هذا الأسلوب، كانت transfected البلازميدات المحتوية على DPC الخاصة بالموقع داخل الخلايا واسترداد الوزن الجزيئي المنخفض الحمض النووي في مختلف الأوقات تعداء فيما بعد. الحمض النووي المستردة ثم يتعرض للملحق التمهيدي حبلا على حدة (الالتهاب) باستخدام تمهيدي يكمل حبلا التالفة بلازميد. منذ بوليميراز "الدنا بوليميراز" كتل الآفة DPC، نسبة الحمض النووي تم إصلاحه لإصلاح الأمم المتحدة يمكن كمياً تقييم استخدام qPCR. تستخدم القيم الحدية (CT) دورة لحساب % إصلاح في نقاط زمنية مختلفة في خطوط الخلايا الخاصة بكل منها. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب qPCR الالتهاب تقييم كمي الإصلاح adduct حركية أي دنا بوليميريز بوليميراز كتل تلك.
Introduction
المبينة في هذا التقرير تحليل القائم على بكر يسمى الالتهاب قبكر. والغرض من هذا الأسلوب هو للتحديد الكمي لإصلاح DPC في بلازميد transfected الحمض النووي في خلايا الثدييات ناقصة ويتقن تصليح. هذا الفحص السريع، والكمية، ومرنة للغاية، ومباشرة إجراءات إصلاح النشاط. وبينما يركز هذا التقرير على استخدام هذه المنهجية لدراسة إصلاح Dpc، توضيح النتائج الواردة أدناه أن إصلاح أي الآفة الذي يمنع [تق] [بولمرس] يمكن دراستها باستخدام هذه المنهجية.
أن الأساس المنطقي وراء تطوير هذا الأسلوب هو التبصر في الآليات التي من خلالها إصلاح خلايا الثدييات Dpc. وخلافا لأنواع أخرى من تلف الحمض النووي، استدعاءات dpc واسع متنوع1،2. وقد أثبتت الدراسات أن مئات بروتينات الخلوية يمكن أن تصبح كروسلينكيد للحمض النووي، وأن لكل بروتين يوجد، من حيث المبدأ، في العديد من سلاسل الجانب الأحماض الأمينية التي يمكن أن تصبح يعلق تساهمي ل الحمض الخلوي الصبغي الخلوي3. وبالإضافة إلى ذلك، هناك العديد من نقاط مرفق الكيميائية للبروتينات على العمود الفقري الحمض النووي، بما في ذلك عدة مناصب على أساس النوكليوتيدات وكذلك على4،ريبوز السكر5. وهذا التنوع الكيميائي يثير احتمال أن المسارات البيوكيميائية متميزة قد يمكن الاعتماد عليه لإصلاح أنواع مختلفة من Dpc. كان هذا القلق في الاعتبار أن وضع مقايسة الالتهاب قبكر.
وقد وضعت عدة تقنيات التبصر في البيولوجيا الجزيئية الخلوية DPC إصلاح. فيما يلي لمحة عامة عن النهج الرئيسية التي تم تطويرها، مع موجز لأهم نقاط القوة والضعف كل أن يمتلكها. يجدر التأكيد على أنه بينما يركز هذا الموجز على دراسات لإصلاح DPC في خلايا الثدييات ثقافة النظم، مساهمات كبيرة للنموذج الحالي لإصلاح DPC قد بذلت استخدام النظم الميكروبية وخالية من الخلايا التي لا يتم مناقشتها في هذا مخطوطة.
ولعل أسهل الاستراتيجية التي يمكن اتخاذها للتبصر في علم وراثة إصلاح DPC هو تقييم حساسية كل منهما إلى موت الخلية في الخلايا البرية من نوع ومتحولة معرضة للعوامل التي تحفز Dpc6،7. هذه الاستراتيجية هو سريع نسبيا، وغير مكلفة، ولا تتطلب خبرات متخصصة تتجاوز القدرة على تنفيذ تقنيات استزراع الخلايا الأساسية. موازنة هذه المزايا هي القيود العديدة لهذا النهج، بما في ذلك ما يلي. أولاً، لا تقيس المقايسة إصلاح الحمض النووي مباشرة. افتراض العمل الأساسية لهذه الاستراتيجية هو أن يخمد الطفرات في الجينات ترميز البروتينات إصلاح الحمض النووي ذات الصلة النتائج في تراكم الحمض النووي الضرر أن موت الخلايا المبرمج المشغلات. بيد الطفرات في الجينات ترميز البروتينات غير إصلاح الحمض النووي يمكن، الرئيسية، تعزيز (أو خفض) الخلوية حساسية لموت الخلايا المستحثة إكسينوبيوتيك. وثانيا، العوامل التي تخلق Dpc دائماً الحث على أنواع أخرى من تلف الحمض النووي (الاستثناء الوحيد 5-عزة-2 '--ديوكسيسيتاديني، ولكن هذا العامل أيضا يستنزف methyltransferase الخلوية مستويات8). ونتيجة لذلك، فمن المتصور أن فرط الخلوية المعززة للوكيل في السؤال قد تعكس العيوب في إصلاح كروسلينكس إينتيرستراند أو غيرها من الآفات. ثالثا، كما ذكر أعلاه، Dpc تمثل فئة غير متجانسة إلى حد كبير يتألف من أنواع مختلفة من كروسلينكس الكيميائية، التي تنطوي على بروتين مختلف الشركاء. فمن الممكن أنه بينما قد يكون تغيير إصلاح أنواع فرعية واحدة أو أكثر من هذه الآفات في خلفية وراثية معينة، هذا الاختلاف قد لا تكفي ليغير كثيرا من فرط الخلوية للوفيات الناجمة عن هذا الوكيل. وخلاصة القول، بينما هذه الاستراتيجية تمثل نقطة انطلاق جذابة، القيود المبينة أعلاه تسليط الضوء على أهمية اتباع أساليب أخرى، وأكثر مباشرة لدراسة الحركية إصلاح DPC.
قد وضعت عددا من النهج ذات الصلة لتحقيق هذا الهدف. على سبيل المثال، وضعت المحققين أساليب التمييز بين الحمض النووي 'الحرة' و 'البروتين-منضم' الحمض النووي9،،من1011. باستخدام هذه النهج، من الممكن لمقارنة مستويات مستقرة Dpc أو بعد التعرض لعامل إنتاج شركة ظفار في الخلفيات الوراثية المختلفة. وتشمل الاستراتيجيات اثنين التي استخدمت على نطاق واسع يفصل DPC التي تحتوي على الحمض النووي DNA مجاناً باستخدام استراتيجية ملزمة غشاء النيتروسليلوز أو بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي هطول الأمطار12،13. في النهج السابق تفكيك الخلايا وتمريرها من خلال مرشح النيتروسليلوز. لأنه يربط النيتروسليلوز البروتين، عامل التصفية تحتفظ بالحمض النووي المرتبطة بالبروتين، والسماح للحمض النووي مجاناً لتمرير من خلال. في استراتيجية الأخير يفصل ربط البروتين الحمض النووي الحمض الحر يستند إلى حقيقة أن الحزب الديمقراطي الصربي بربط البروتين ولكن ليس من الحمض النووي، ويمكن أن تكون عجلت بإضافة بوكل. ونتيجة لذلك، يصبح الحمض النووي المرتبطة بالبروتين غير قابلة للذوبان بينما يبقى الحمض النووي غير منضم في الحل. DPC التي تحتوي على الحمض النووي يمكن أن تكون كوانتيتاتيد ثم استخدام thymidine راديولابيليد (إذا كان في البداية أيضي المسماة الخلايا) أو بصبغة فلورسنت الحمض النووي انتقائية مثل هويشت 33258. هذه الأساليب هي استنساخه وتتطلب عدد قليل من الخطوات. ومع ذلك، لا توفر معلومات بشأن الطبيعة التشعب الكيميائية التي من خلالها يتم إرفاقه البروتين الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه الاختبارات قد تقدر الإفراط DPC إصلاح بواسطة زورا وسجل إصلاح غير مكتملة، أي، proteolytic تجهيز لأصغر crosslinks الببتيد الحمض النووي قد لا يكون محاصراً بسهولة أو عجل، كالحمض النووي حسن النية إصلاح.
يمكن استخدام فحوصات المذنب تصور تشكيل DPC في الخلايا14. في هذه التجارب، وتقليل وجود Dpc الهجرة الحمض النووي الذي يمكن عكسه ثم تقشير مع بروتيناز ك. ولذلك، يمكن استخدام طول الذيل لتقدير تشكيل DPC. ومع ذلك، كما ذكر أعلاه، المخدرات تشكل DPC إنشاء أنواع أخرى من تلف الحمض النووي الذي يمكن أن يؤدي تغيير طول ذيل. هذا البروتوكول هو أيضا درجة عالية من التقنية ويتطلب الخبرة والتدريب في مجال التصوير [كنفوكل].
يمكن استخدام الطيف الكتلي لدراسة حركية الإصلاح قد أبرمت بعد العلاج مع crosslinking وكلاء15،،من1617. علاج الخلايا مع وكلاء شركة ظفار تشكيل هذه التجارب وعزل Dpc عبر البيوتين الالتقاط أو الفينول: كلوروفورم الاستخراج (1:1). ثم يمكن استخدام الطيف الكتلي لتحديد البروتينات كروسلينكيد أو كوانتيتاتي مبلغ DPCs التي تشكلت على مر الزمن. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو طبيعة البيانات المنتجة. فمن الممكن على وجه التحديد كتالوج أنواع البروتينات التي تصبح كروسلينكيد عقب التعرض إلى إكسينوبيوتيك، ولكن هذا البروتوكول مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وهي محدودة بنوع التشعب يمكن الكشف عنها.
مايزلس et al. المتقدمة حساسة 'رادار' (النهج السريع للحمض النووي adduct الاسترداد) المقايسة كوانتيتاتي إيمونوديتيكشن بروتين الحمض النووي adducts كذلك رادار على أساس أليسا مقايسة18،19. هذه الاختبارات مفيدة بشكل خاص لمحاصرة وسيطة الحمض النووي-بروتين عابر في الخلايا وتوليد نماذج مناسبة للتحليل الطيفي الشامل لتحديد البروتين الجديد أدوكتس. هذا الإنزيم إيمونوديتيكشن يعتمد على وجود الأجسام المضادة لالتقاط التشعب البروتين الحمض النووي، وعليه، قد لا تكون قادراً على الكشف عن الحمض النووي-ببتيد المتدهورة adducts هذا النموذج أثناء إصلاح. في الآونة الأخيرة، إصلاح DPC محددة المسار مرتبطة بتكرار الحمض النووي، وتعتمد على الحمض النووي ميتالوبروتيسي المتقشف اكتشفت في Dpc التي يتم بروتيوليزيد على الببتيدات أصغر أثناء إصلاح20،21. الموروثة من الطفرات في هذا الجين المرتبطة بمتلازمة راييس-آلفس في البشر، وهو مرض يتسم بعدم الاستقرار المجيني والشيخوخة المبكرة وسرطان الكبد22. عرض الفئران بعيوب الجينات المهندسة وراثيا المتقشف مماثلة تعمل23.
وقد استخدمت تنشيط الخلية المضيفة نشاط النسخي لدراسة إصلاح آفات محددة موجودة على transfected بلازميد الحمض النووي ركائز24،25. في هذه التجارب، بلازميد يحتوي على Dpc (أو أنواع أخرى من الآفات الحمض النووي) التي منع النسخ من مراسل، مثل لوسيفراس، وهي ترانسفيكتيد في الخلايا. إصلاح التﻷلؤ القياسات في وقت لاحق اتخذت 24-72 ح ثم يرتبط مع DPC. بيد أن هذه الاختبارات غير المباشرة إصلاح عاجزة عن الكشف عن أحداث إصلاح أقدم من تعداء بعد 24 ساعة ولا يميز بين تجاوز بوليميريز الحمض النووي الريبي من ركائز إصلاح جزئي واستكمال إصلاح.
كل واحد من الأساليب المذكورة أعلاه ومزايا وساهم النموذج الحالي لإصلاح DPC. ومع ذلك، الإنزيم qPCR الالتهاب تلتف العديد من القيود المرتبطة بهذه النهج الأخرى وبالتالي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة DPC إصلاح آليات أكثر تحديداً. على سبيل المثال، قياس الإنزيم qPCR الالتهاب مباشرة إصلاح Dpc الخاصة بالموقع على الحمض النووي في خلايا الثدييات سليمة. هذا الأسلوب هو تنوعاً، وقد استخدمت للحصول على نتائج إصلاح عقب تعداء في الهامستر وخطوط الخلايا البشرية. تعداء بلازميد يمكن أن يؤديها باستخدام ليبوفيكشن أو انهانسر في خطوط خلايا الثدييات. كما يضمن أن يقاس فقط إصلاح Dpc محددة، ولا أنواع أخرى من تلف الحمض النووي الناجم عن معظم وكلاء تشكيل DPC. الالتهاب-قبكر سهلة لتنفيذ وغير مكلفة وسريعة. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الفحص اكتشفت أحداث إصلاح لها في أقرب وقت تعداء بعد ح 2. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراسة المتغيرات التي قد تؤثر على نتائج إصلاح DPC بطريقة حساسة وفعالة. على سبيل المثال، دور النسخ في إصلاح DPC لم يتم تقييم صارم. بسبب مرونة الإنزيم qPCR الالتهاب، يمكن التلاعب بها موقع كروسلينكينج شركة ظفار لمعالجة هذه المسألة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام مقدمة مصدر للنسخ المتماثل إلى بلازميد DPC الحاملة لمعالجة تأثير النسخ المتماثل على إصلاح DPC. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إنشاء كروسلينكس متعددة على بلازميد دراسة الاختلافات في إصلاح DPC واحد مقابل كروسلينكس متعددة. هذه هي الأسئلة التي سيكون من الصعب الإجابة باستخدام الحمض النووي صبغية ولكن يمكن معالجتها بسهولة باستخدام مقايسة الالتهاب قبكر. عموما، يتطلب الفحص qPCR الالتهاب تنقيته، بلازميد الحمض النووي في كميات ميكروغرام المحتوية على آفة موقع معروف. أدوكتس إلى جانب DPC يمكن أن تستخدم في هذا التحليل، ولكن يجب أن الآفة قادرة على منع امتداد من [تق] [بولمرس].
Protocol
1-جيل بلازميد المحتوية على شركة ظفار
- الجمع بين بمول 80 من اليغنوكليوتيد التي تتضمن بقايا 8-أوكسوجوانيني (20 ميليلتر) مع 10 وحدات من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (1 ميليلتر) في المخزن المؤقت ليجاسى x 10 (5 ميليلتر). إضافة الماء تصل إلى إجمالي حجم 50 ميليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي ساخن.
- الجمع بين اليغنوكليوتيد فوسفوريلاتيد (50 ميليلتر)، بمول 80 من الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (80 ميكروليتر)، 100 وحدة بوليميراز بوليميراز (20 ميليلتر) في 10 x Taq رد فعل المخزن المؤقت (25 ميليلتر)، ATP 100 مم (20 ميليلتر)، دنتبس 10 مم (20 ميليلتر)، NEB المخزن المؤقت 2 (25 ميليلتر)، و 8 ميكروغرام جيش صرب البوسنة (20 ميليلتر) مجموع 260 ميليلتر. إينكوباتي عينة في ثيرموسيكلير تعيين عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تليها 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك إضافة 60 يو T4 بوليميراز (20 ميليلتر)، 8,000 T4 يو ليجاسى (20 ميليلتر)، 100 ملم ATP (20 ميليلتر)، دنتبس 10 مم (20 ميليلتر)، NEB المخزن المؤقت 2 (15 ميليلتر)، و 8 ميكروغرام جيش صرب البوسنة (20 ميليلتر) مجموع 375 ميليلتر. احتضان رد فعل بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية (الشكل 1A).
- إنشاء مزيج فينول: كلوروفورم العازلة المشبعة 50: 50. إضافة كميات متساوية من كل مكون، مزيج، وتدور في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 21,130 س ز لأدنى 5 كلوروفورم محركات المياه من الفينول العازلة المشبعة بتشكيل طبقتين: طبقة علوية، والمائية والقاع، والطبقة العضوية. إضافة ميليلتر 375 من الطبقة الدنيا، والعضوية إلى رد فعل التمديد التمهيدي، مزيج، وتدور في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 21,130 س ز لمدة 5 دقائق.
تنبيه: الفينول كلوروفورم والمواد الخطرة وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب ملامسة الجلد أو العينين.- عقب الطرد المركزي، بعناية استخراج الطبقة العليا وخلط مع خلات الأمونيوم إضافة إلى تركيز نهائي من 0.3 M متبوعاً بكميات الإيثانول 100% 2. تخزين الحل في-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو طوال الليل.
- تدور العينة في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي في 15000 لفة في الدقيقة العاشرة في 4 درجات مئوية عن 10 دقيقة إزالة المادة طافية وتغسل بيليه في 1 مل إيثانول 70%. تدور العينة في أعلى الجدول للطرد مركزي في 15000 لفة في الدقيقة العاشرة في 4 درجات مئوية كحد أدنى 5 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من الماء.
- الجمع بين 50 ميليلتر من الحمض النووي من الخطوة السابقة مع ميليلتر 16 6 س جل-تحميل صبغ و 34 ميليلتر المياه ورهنا بالتفريد على نسبة 0.8% ذوبان منخفضة [اغروس] هلام المحتوية على 0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. تشغيل الهلام في الخامس/سم 2 على جل 10 سم ح 6 في المخزن المؤقت x TAE 1. المكوس الفرقة سوبيركويليد باستخدام شفرة حلاقة وتزن الشريحة هلام (الشكل 1A). تشغيل عنصر تحكم إيجابية ليكون بمثابة علامة حيث يهاجر الحمض النووي تساهمي مغلقة، سوبيركويليد.
تنبيه: اثيديوم بروميد مطفر وينبغي اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب ملامسة الجلد. أيضا، من المهم تقليل الوقت الذي عينة بلازميد يتعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل الحد من تشكيل برومة الأشعة فوق البنفسجية.- هضم الشريحة جل بإضافة 10% β-أجاراسي رد فعل المخزن المؤقت لكل ملغم من وزن هلام. احتضان عند 65 درجة مئوية 10 دقيقة وباردة إلى 42 درجة مئوية. إضافة 10 يو من β-أجاراسي واحتضان في 42 درجة مئوية ح 1.
- حضانة التالية، قياس الحجم وإضافة خلات الأمونيوم إلى تركيز نهائي 0.3 م والبرد على الجليد ل 15 دقيقة للطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وجمع المادة طافية، وإضافة وحدات التخزين 2 من الايزوبروبانول. البرد في-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- الطرد المركزي في الحمض النووي المنقي، سوبيركويليد لمدة 10 دقائق في 15000 لفة في الدقيقة العاشرة في أعلى الجدول للطرد مركزي في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه في 40 ميليلتر من الماء.
- Pmol 12 التشعب (15 ميليلتر) من الحمض النووي إلى 36 بمول من جليكوسيلاسي أوكسوجوانيني (1 ميليلتر) في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 100 مم كلوريد الصوديوم (3 ميليلتر)، 1 مم مجكل2 (3 ميليلتر)، 20 تريس-HCl pH 7.0 (6 ميليلتر)، و 10 ملم الصوديوم سيانوبوروهيدريدي (2 ميليلتر) للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 30 ميليلتر في 37 درجة مئوية ل 26من 30 دقيقة. إزالة 1 ميكروليتر من عينة كروسلينكيد وتمييع في 500 ميليلتر من الماء ليكون بمثابة ح 0 نقطة البيانات وتحليل PCR في الخطوة 3.
2-بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي هطول الأمطار
- تصور الكفاءة كروسلينكينج، هضم تقييد 1 ميكروغرام من بلازميد كروسلينكيد مع 1 ميكروليتر DI باهوجان ساماجفي المخزن المؤقت x 10 في 37 درجة مئوية ح 1 لتوليد أجزاء الحمض النووي الحجم مختلفة اثنين.
ملاحظة: سيتم بلغة واحدة كروسلينكيد للبروتين (4.4 كيلو بايت) وأخرى لن (2.8 كيلو بايت) (الشكل 1B).- تقسيم العينات إلى النصف، إضافة الحزب الديمقراطي الصربي على حد سواء إلى تركيز نهائي من 0.5%، واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إضافة بوكل (تركيز نهائي 100 مم) إلى واحدة من العينات واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق.
- الطرد المركزي كل العينات في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وتشغيلها في supernatants على [اغروس] هلام لتقدير نسبة تصريف البروتين للحمض النووي12.
ملاحظة: يتم استخدام الأمطار بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي لمراقبة الجودة، وعدم إعداد سفلية.
3-تعداء في خلايا الثدييات
- يوم واحد قبل تعداء، لوحة 0.5 × 106 خلايا/بئر في لوحة 6-جيدا. في اليوم التالي، مزيج 1.5 ميكروغرام (30 ميليلتر) من بلازميد المحتوية على شركة ظفار (من الخطوة 1، 6) مع 300 ميليلتر لوسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. في أنبوب آخر، مزيج ميليلتر 12 من كاشف تعداء و 300 ميليلتر لوسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل. والجمع بين 300 ميليلتر من الحمض المخفف مع 300 ميليلتر من كاشف تعداء المخفف واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 250 ميليلتر من المجمعات إلى كل من بئرين واحتضانها للحد أدنى من 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- بعد الحضانة، قم بإزالة الوسائط وإضافة 1 مل يدتا الحزب الديمقراطي الصربي/0.01 M 0.6 في المائة، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لتتخلص الخلايا باستخدام شرطي مطاط من 10-15 دقيقة ونقل إلى 1.5 مل [ميكروفوج] أنابيب. إضافة 200 ميليلتر من "كلوريد الصوديوم م" 5 (تركيز نهائي 1 م)، عكس بلطف 5 مرات، واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها27.
- الطرد المركزي هذه العينات في س 21,130 ز في أعلى الجدول--أجهزة الطرد مركزي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وجمع متسرعا الإيثانول طافية، كما هو موضح أعلاه، وريسوسبيند في 50 ميليلتر من الماء.
4-الالتهاب--قبكر
- مزيج معا 1 ميليلتر من الحمض النووي تم استردادها من كل وقت نقطة (بما في ذلك 0 ح)، 2 x ميكس سيد بكر سيبر الخضراء (30 ميليلتر)، 27 ميليلتر من الماء، و 1 ميليلتر (بمول 100) للتمهيدي يكمل حبلا الضرر من بلازميد (R التمهيدي، الشكل 2). إجراء PCR استخدام الشروط التالية: الأولى تذوب قبل 10 دقيقة عند 90 درجة مئوية، تليها 8 دورات: 90 درجة مئوية، 15 ثانية، 65 درجة مئوية، 1 دقيقة. عند انتهاء دورة إضافة 8 1 ميليلتر (بمول 100) للتمهيدي الثاني بإجمالي 60 ميليلتر (L التمهيدي، الشكل 2)28 (انظر الجدول للمواد للحصول على تفاصيل الكاشف).
- استرداد ميكس 1 ميليلتر من unamplified الحمض النووي من كل وقت نقطة (بما في ذلك 0 ح)، 2 x ميكس الرئيسي (30 ميليلتر)، 27 ميليلتر من الماء، و 1 ميليلتر من كل التمهيدي (بمول 100) لعدد 60 ميليلتر.
- تحميل لوحة بكر 96-جيدا مع العينات من الخطوات 4.1 و 4.2 (20 ميليلتر/جيدا، في ثلاث نسخ) وأداء qPCR لدورات 30 استخدام الشروط الموضحة أعلاه.
- متوسط القيم CT من كل مجموعة من ثلاث عينات. طرح القيم المقطعية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 1 من تلك الموجودة في الخطوة 4، 2 للحصول على دلتا نهر قيمة الأشعة المقطعية لكل عينة. طرح النقطة 0 ح الوقت من قيمة دلتا CT لإزالة أي خلفية (انظر نتائج ممثل قسم للحصول على وصف مفصل).
- تحويل دلتا نهر CT قيمة إصلاح النسبة المئوية باستخدام الصيغة:
Representative Results
من أجل الاستفادة من التحليل الالتهاب qPCR لتقييم الإصلاح DPC الخلوي، يجب إعداد كمية كافية (المبالغ ميكروغرام) من الركازة إصلاح DPC عالية الجودة. للحصول على هذا المنتج، كان اليغنوكليوتيد التي تحتوي على بقايا 8-أوكسوجوانيني الملدنة ليكمل الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل، التمهيدي الموسعة، وجل المنقي لضمان استخدام المنتج دائرية مغلقة فقط تساهمي، ترانسفيكشنز (الشكل 1A). ويركز هذا التقرير على ركائز فيها تعويض بورهيدريد يستخدم لإنشاء من التشعب التساهمية بين جليكوسيلاسي أوكسوجوانيني البشري الماشوب ووحدة ريبوز في جزيء بلازميد دائري مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، على الرغم من تماثل النهج يمكن استخدامها للحصول على ركائز DPC كيميائيا المتنوعة. وتتمثل الاستراتيجية الملائمة جليكوسيلاسي/بورهيدريد أوكسوجوانيني جاذبية خاصة نظراً لكفاءة عالية للغاية من رد فعل كروسلينكينج. كما هو مبين في الشكل 1 باء، هطول الأمطار بوكل/الحزب الديمقراطي الصربي يقوم على الركازة DPC التي قد تم هضمها إلى قسمين الشظايا بشكل انتقائي والكمية تقريبا المنضب جزء الحمض النووي على إيواء في DPC. هذه النتائج تؤيد الاستنتاج بأن أساسا 100% جزيئات الركازة بلازميد يتضمن من التشعب بروتين.
والرزن qPCR الالتهاب الموصوفة في المقطع بروتوكول يستخدم القيم المقطعية التي تم إنشاؤها بواسطة qPCR لحساب النسبة المئوية لإصلاح DPC عقب تعداء في خلايا الثدييات. وكما يبين الشكل 2 ، كتل التشعب البروتين [تق] [بولمرس] من توسيع التمهيدي 'R' تعتيق حبلا المحتوية على شركة ظفار. ميزة حاسمة، والثاني من هذا التحليل هو إدراج ثماني جولات من تفاعلات الالتهاب (باستخدام الدليل التمهيدي R) قبل إجراء الفحص قبكر. بينما الحمض النووي غير التالفة (أو إصلاحه) سيمتد خلال هذه التفاعلات الالتهاب، إنشاء موقع ربط للتمهيدي 'ل' المصب، تلف الحمض النووي (أو الحمض النووي غير كامل تم إصلاحه) سوف لا تمدد. ونتيجة لذلك، يزيد الالتهاب الوفرة من كل حبلا غير التالفة (أو إصلاحه) قبل اايتفولد. وهذا يعني أن إصلاح العينات التي قد أنجز خطوة الالتهاب قبل qPCR سيتم عرض قيمة الأشعة المقطعية ثلاث وحدات أقل من تلك التي تم الحصول عليها لنموذج مطابق الذي أنجز الالتهاب لا قبل قبكر (الشكل 2). الفرق الثلاثة-الوحدة في القيم المقطعية للعلاجات اثنين، يشار إلى ΔCT، ويعكس الحقيقة أن 8 = 23. يمكن استخدام هذا دلتا قيمة الأشعة المقطعية لحساب الحمض الخلوي إصلاح النشاط باستخدام الصيغة: نسبة إصلاح الحمض النووي = (2ΔCT/23) x 100. وأكدت تجارب التحكم أن دلتا CT قيمة حوالي 3 لوحظ استمرار عندما تعرض والبلازميدات الركيزة غير التالفة للالتهاب-قبكر (البيانات لا تظهر).
يصف الجدول 1 القيم المثال الأشعة المقطعية التي تم إنشاؤها من ركائز بلازميد المحتوية على DPC التي كانت تعافي من الهامستر الصيني الرئة الليفية 3 ح وح 8 بعد تعداء (الجدول 1A)، فضلا عن من الوقت صفر العينات، أي، العينات التي تم إعداد كما هو موضح في المقطع بروتوكول، ولكن لا ترانسفيكتيد داخل الخلايا (الجدول1 باء). ويقدم الجدول أيضا ΔCT، وإصلاح المئة القيم (محسوبة باستخدام الصيغة 2ΔCT23 x 100) التي تم الحصول عليها من هذه العينات. كما هو موضح في الجدول 1 ألف، إصلاح النسبة المئوية محسوبة من عينات المقطوع ح 3 وتعداء بعد ح 8 كان 66% و 93% على التوالي. يتم طرح هذه القيم ثم من التي تم الحصول عليها من تحليل العينة 0 ح لتحديد النسبة المئوية لإصلاح. يصف الجدول 1 باء القيم المقطعية لعينات مختلفة 0 ح اثنين الذي كان crosslinking كفاءة أو لم يتحقق قبل تعداء. كفاءة كروسلينكيد عينة أسفر دلتا CT قيمة 0.8 حين عينة كروسلينكيد سيئة أدت إلى دلتا CT قيمة 2.5. وحتى الآن، لم يمكن دقة تحديد مصدر الإشارات الخلفية 0.8 في كفاءة كروسلينكيد 0 ح عينة. فإنه من غير المحتمل أن هذه الخلفية ويعكس تدني مستوى أما إزالة DPC عفوية، أو هو بسبب انخفاض مستوى بوليميراز بوليميريز 'تجاوز' التوليف عبر الآفة DPC: تجارب واسعة النطاق أجريت على تنقية عالية الركيزة M13 واحد-الذين تقطعت بهم السبل استمرار أسفرت عن دلتا CT قيمة 0.8 تقريبا، أيمطابقة أساسا لهذا 'الخلفية' ملحق ينظر في الركازات المحتوية على DPC. ونتيجة لذلك، فمن المحتمل أن هناك درجة صغيرة من سوء فتيلة التمهيدي 'R' أثناء الالتهاب الذي يؤدي إلى توليد كمية صغيرة من المنتجات التي يمكن توسيعها فيما بعد عندما تتم إضافة التمهيدي 'ل' و qPCR تنفيذه. أن الجهود المبذولة للقضاء على هذه الخلفية عن طريق التلاعب في شروط PCR، حتى الآن، فشل في تصحيح هذا الخلل. ومع ذلك، يسمح استراتيجية الطرح الوارد وصفها أعلاه تقدير دقيق لنشاط إصلاح DPC. أنه يستحق مشيراً إلى أن كروسلينكينج غير فعالة من البروتين على بلازميد سيؤدي إلى قيمة مرتفعة خلفية. ويرد هذا في نموذج البيانات المقدمة في الجدول 1 باء حيث أسفر crosslinking عدم كفاءة البروتين-الحمض النووي دلتا أعلى قيمة الأشعة المقطعية للوقت 0. ولذلك، تجري تجارب التحكم دائماً قبل الشروع في ترانسفيكشنز وركائز مع دلتا CT قيم مرتفعة أعلاه 0.8 يتم تجاهل مستوى العتبة. كما ورد في بروتوكول قبكر، ينقسم كل عينة إلى الآبار 3 لضمان اتساق بيبيتينج. ثم يتم حساب متوسط هذه replicates الحصول على قيمة الأشعة المقطعية لهذه العينة. وإنشاء نسخ متماثلة على إلغاء تنحرف أكثر من ± 0.1 من مجموعة البيانات. إذا replicates الثلاثة جميع تنحرف أكثر من ± 0.1 من بعضها البعض، هو إعادة بنائه الإنزيم qPCR الالتهاب حتى يتم الحصول على القيم متسقة. وتبين التجربة أنه يجب إجراء ترانسفيكشنز مستقلة على الأقل 3 للحصول على متوسط قيم موثوق بها ثم يمكن إخضاعها للتحليل الإحصائي لتحديد تأثير المعلمات المختلفة على كفاءة إصلاح DPC.
رقم 1. جيل من بلازميد المحتوية على DPC. (أ) اليغنوكليوتيد المحتوية على تعتيق واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (دائرة أسود غامق) بقايا 8-أوكسو-جوانين (أحمر) وتمتد إلى إنشاء مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل بلازميد (تمديد التمهيدي المنتج المبين بخط متقطع). وبعد التفريد في اثيديوم بروميد، اقتطعت من ذوبان منخفضة [اغروس] هلام الفرقة المقابلة للحمض النووي سوبيركويليد (المربع الأحمر) وهضمها مع β-أجاراسي. الممرات: (1) الوزن الجزيئي ماركر، الحمض النووي (2) واحد الذين تقطعت بهم السبل، الحمض النووي (3) المزدوجة الذين تقطعت بهم السبل، (4) التمهيدي تمديد العينة. (ب) أوكسوجوانيني جليكوسيلاسي (hOGG1 المختصر، وصفت دائرة أورانج) كروسلينكيد لبقايا 8-أوكسو-جوانين عبر سيانوبوروهيدريدي الصوديوم والركيزة DPC الناتجة عن هضم لتوليد زوج قاعدة 2,800 والحرة الحمض النووي جزء من 4,400 زوج قاعدي بلغة يعلق على البروتين. الحزب الديمقراطي الصربي إضافة إلى العينة ثم ينقسم إلى جزأين، أحدهما هو تعامل مع بوكل وتثفيل للرواسب DPC التي تحتوي على الحمض النووي (وصفت بيليه برتقالي). المادة طافية من هذا النموذج الأخير (يصور كالأزرق مائع في أنبوب الطرد المركزي) والعينة لا يتعرض إلى بوكل يتعرضون لجل التفريد. الممرات: (1) الوزن الجزيئي ماركر، (2)-بوكل، (3) + بوكل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التحديد الكمي بلازميد التالفة عن طريق الالتهاب-قبكر- بلازميد الحمض النووي هو التشويه والتحريف وتمهيدي يكمل حبلا التالفة (R) هو تعتيق والموسعة. يتم تكرار هذه العملية لما مجموعة 8 دورات. مع الركازة تالفة (أعلى)، [تق] [بولمرس] يتم حظره بواسطة الآفة DPC ولن تنتج خيوط منتج كامل طول. وفي المقابل، مع الركازة إصلاحه (أسفل)، [تق] [بولمرس] سوف تنتج خيوط كامل طول المنتج الذي يحتوي على الموقع ملزم للتمهيدي ل. بعد 8 دورات، تتم إضافة التمهيدي ل، وقيم العتبة دورة مصممون على استخدام قبكر. يوضح المثال تضخيم النتائج لركائز المعطوبة وغير التالفة على الحق مع الخط الأحمر الذي يمثل الحمض النووي الذي خضع لتمديد التمهيدي قبل قبكر والأزرق يمثل الحمض النووي الذي لم يكن التمهيدي الموسعة قبل قبكر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الجدول 1 ألف | ||||
| الوقت | -ملحق التمهيدي | + ملحق التمهيدي | Δ CT | إصلاح النسبة المئوية |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| ح 3 | 23.5 | 21.1 | 2.4 | 66 |
| ح 8 | 29.4 | 26.5 | 2.9 | 93 |
| الجدول 1 باء | ||||
| الوقت | -ملحق التمهيدي | + ملحق التمهيدي | Δ CT | خلفية النسبة المئوية |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| ح 0 | مقاس 15.4 بوصة | 14.6 | 0.8 | 22 |
| ح 0 | مقاس 15.4 بوصة | 12.9 | 2.5 | 71 |
الجدول 1: حساب المئة إصلاح استخدام قيم CT المتولدة من الالتهاب-قبكر- (أ) إصلاح الركازة المحتوية على DPC transfected في V79 الهامستر الصيني الرئة الليفية 3 ح وح 8 تعداء بعد. (ب) الالتهاب qPCR العينات 0 ح لا ترانسفيكتيد داخل الخلايا. كان في عينة واحدة فعالية رد فعل crosslinking بين الحمض النووي وأوكسوجوانيني جليكوسيلاسي عالية (هذه العينة أسفرت عن قيمة دلتا منخفضة CT) بينما في العينة الأخرى كفاءة crosslinking البروتين كان منخفضا (هذه العينة أسفرت عن دلتا عالية نسبيا قيمة CT). انظر النص من النتائج ممثلة للحصول على التفاصيل.
Discussion
الأسلوب الالتهاب qPCR يوفر مزايا عديدة أكثر من غيرها من النهج بدراسة إصلاح عدد السكان متجانسة تحتوي على آفة DPC وحيد ومحدد. جدير بالذكر أن بالإضافة إلى مراقبة الهوية من البروتين والنوع من التشعب الكيميائية المستخدمة للاتصال البروتين بالحمض النووي، من الممكن بسهولة التلاعب سياق التسلسل الذي يتم عرض الآفة DPC. وقد بحثنا تأثير على إصلاح DPC إدخال الآفة أما على القالب أو الترميز حبلا بلازميد مجرى النهر من محور بروموتور النشطة. وبالمثل، نحن بصدد التحقيق في تأثير على إصلاح DPC للنسخ المتماثل باستخدام بلازميد M13 التي تحتوي على مصدر SV40 النسخ المتماثل ترانسفيكتيد إلى خلايا HEK293T. المقايسة الموضحة هنا مباشرة تدابير إصلاح DPC، بدلاً من الاستراتيجيات الأخرى مثل تنشيط الخلية المضيفة أن تقديرات غير مباشرة إصلاح النشاط24،25. وبالإضافة إلى ذلك، النظام قوي وحساس، والكمية. بخلاف النظم الأخرى، التي تقيس إزالة DPC، يكشف هذا الفحص فقط استكمال إصلاح الأحداث، أي، فإنه يتطلب ليس فقط أن تكون إزالة الآفة DPC ولكن أن تكون سلامة الحمض النووي المزدوجة تماما استعادة17. وهذا لأن المواقع الأساسية والنكات أو فواصل في العمود الفقري phosphodiester كتلة الإنزيم فعالية ك الآفة DPC الأصلي29.
وبينما يركز هذا التقرير على نوع معين من شركة ظفار، الذي تم إنشاؤه بمحاصرة بورهيدريد لفعل إنزيم الوسيطة، نحن حاليا بوضع نهج لدراسة إصلاح DPCs التي تنطوي على البروتينات الأخرى والآفات التي ربط البروتين إلى الحمض النووي يحدث عن طريق قاعدة نوكليوزيد، بدلاً من موقف الريبوز. استخدام amination التخفيض، وقد أنشأنا crosslinks البروتين والببتيد موصولة إلى جوانين أو السيتوزين قاعدة ل الحمض النووي التمهيدي30. هذه النوكليوتيد تنقيته للتجانس واستخدامها لتوليد والبلازميدات سوبيركويليد التي تحتوي على الحمض النووي من البروتين والحمض النووي-الببتيد كروسلينكس. بينما يتم تقليل كفاءة هذه التفاعلات إلى حد ما بالنسبة إلى النهج التشعب جليكوسيلاسي أوكسوجوانيني الذي وصف بالتفصيل أعلاه، أنها كانت ناجحة، وتسمح بدراسة إصلاح هذه ركائز في البرية من نوع وخطوط خلايا الثدييات تفتقر إلى إصلاح الختان النوكليوتيدات. أننا استخدمنا أيضا مقايسة الالتهاب qPCR لدراسة إصلاح آفات أوكسوجوانيني والمتقارن الكوليسترول ريبوز اصطناعية، الذي أبدى قبل يمكن إصلاحه عن طريق إليه إصلاح الختان النوكليوتيدات الخلوية31. وكما يبين الشكل 2 بيانيا، إصلاح أي الآفة أن تمديد التمهيدي كتل من [تق] [بولمرس] يمكن، من حيث المبدأ، أن تقاس باستخدام مقايسة الالتهاب قبكر.
النماذج الحالية لإصلاح DPC توحي بأن Dpc أكبر (> كاتشين 10) تخضع للمعالجة بروتيوليتيك للآفة الببتيد أصغر قبل إزالة32،،من3334. المرشحين الأكثر احتمالاً مسؤولة عن هذه بروتيوليسيس هي بروتوزوم أو حوزتي محددة في الخلايا البشرية المسمى المتقشف20،21،35،،من3637، 38-يمكن إجراء تحقيقات إضافية في الأدوار هذه البروتياز باستخدام مقايسة الالتهاب qPCR. ويمكن استخدام مثبطات بروتوزوم بريتريت الخلايا قبل تعداء مع ركائز المحتوية على DPC. وبدلاً من ذلك، يمكن أن transfected خطوط الخلايا ضربة قاضية المتقشف مع والبلازميدات التالفة توضيح دورها في بروتيوليسيس من أكبر Dpc.
بغض النظر عن الطريقة المستخدمة لإنشاء في التشعب أو طبيعة الآفة الحمض النووي، يجدر التأكيد على أن المنهجية qPCR الالتهاب لا يتوقف بصورة حاسمة على القدرة على توليد كميات كبيرة من الركازة بلازميد DPC متجانسة. الخطوات الأساسية لهذا التحليل وتشمل تنقية تساهمي أو بلازميد دائرية مغلقة عقب تمديد التمهيدي للقضاء على أي رصدت الجزيئات بلازميد الخطي. يجب إزالة هذه الملوثات لضمان أن أي إصلاح DPC اللاحقة ولاحظ ليس بسبب عمليات إصلاح كسر الموجه الموجه نك أو مزدوجة-حبلا. قد يمكن التغلب على عدم الحصول على كميات كافية من الحمض النووي سوبيركويليد في أعقاب ردود الفعل تمديد التمهيدي باختلاف نسبة اليغنوكليوتيد الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. خطوة هامة أخرى لأسلوب الالتهاب قبكر، هو كفاءة crosslinking البروتين بلازميد. في هذه الدراسة، تم استخدام فعل تتسم بالكفاءة، والانزيميه للبروتين جليكوسيلاسي أوكسوجوانيني على آفة 8-أوكسو-جوانين التشعب. ويمكن تحسين crosslinking الفرعي الأمثل قبل الكمية من البروتين إضافة إلى ردود فعل متفاوتة.
بينما تعتمد النتائج الواردة في هذا التقرير على ليبوفيكشن لإدخال ركائز إصلاح DPC في الخلايا المتلقية، لا يوجد أي سبب، بداهة، لا يمكن استخدام أساليب أخرى ترانسفيكشنز. قمنا بإجراء الدراسات الأولية ولاحظ أن انهانسر39 يمكن أن تستخدم أيضا. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن تجربتنا وهو انخفاض كفاءة تعداء انهانسر ليبوفيكشن بالمقارنة مع، ووجدنا أنه من الضروري استخدام الحمض النووي الناقل (ما يصل إلى 5 ميكروغرام) بالإضافة إلى 1.5 ميكروغرام من الركازة DPC للحصول على بيانات إصلاح. وعموما، qPCR الالتهاب الطريقة الموضحة أعلاه يوفر طريقة مبتكرة حصرا النظر في إصلاح DPC في بلازميد الحمض النووي وتوليد ثاقبة جديدة استجابة تلف الحمض النووي.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من "المعاهد الوطنية للصحة" (ES023350). ليزا تشيسنير معتمد من قبل 5T32HL007741 "المنح التدريبية". ونحن نشكر ناتاليا تريتياكوفا (جامعة مينيسوتا) وأشيس باسو (جامعة كونيتيكت) وأعضائها مختبر للدعم والمشورة التقنية خلال وقت مبكر والمراحل المتوسطة لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
References
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
- At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
- Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
- Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
- Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
- Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J.
- Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
- Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
- Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
- Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
- Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
- Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
- Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).
- Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
- Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
- Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
- Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
- Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
- Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
- Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
- George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
- Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
- Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
- Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
- Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
- Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).
