Summary
이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.
Abstract
이 방법의 목적은 포유류 세포에서 DNA-단백질 crosslink (DPC) 수리의 활동을 검토 하는 유연 하 고 신속한, 양적 기법을 제공 하는 것입니다. 세계적으로 xenobiotic 유도 또는 자발적인 염색체 DPC 제거의 제거 시 금, 보다는 오히려이 분석 결과 균질, 화학적으로 정의 된 병 변 특히 플라스 미드 DNA 기판 내에서 한 사이트에서 도입의 수리를 검사 합니다. 중요 한 것은,이 방법은 방사성 물질의 사용을 방지 하 고 비싼 또는 높은 전문 기술에 종속 되지 않습니다. 대신, 그것은 DNA 재조합 표준 절차와 널리 실시간, 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 계측에 의존합니다. 활용 하는 전략의 고유의 유연성, 가교 된 단백질의 크기 화학 결합 및 정확한 DNA의 특성을 감안할 때 첨부 파일이 사이트의 시퀀스 컨텍스트는 이들의 각각 기여를 해결 하기 위해 변화 될 수 있습니다. DPC 수리의 전반적인 효율성 매개 변수입니다. 이 메서드를 사용 하 여 사이트별 DPC를 포함 하는 플라스 미드는 세포로 페 했다 및 낮은 분자량 DNA 복구 후 transfection 시간 다양 한에서. 복구 된 DNA는 가닥 특정 뇌관 연장 (SSPE) 플라스 미드의 손상 된 물가에 보완 뇌관을 사용 하 여 다음 대상이 됩니다. DPC 병 변 블록 Taq DNA 중 합 효소, 이후 취소 복구에 복구 된 DNA의 비 수 수 양적 평가 정량 Pcr를 사용 하 여. 사이클 임계값 (CT) 값 % 각각 세포 라인의 다양 한 시간 지점에서 수리 계산에 사용 됩니다. 양적 평가 수리 하이 SSPE 정량 메서드를 사용하실 수 있습니다 어떤 DNA의 활동 adduct 그 블록 Taq 중 합 효소.
Introduction
여기에 설명 된 PCR 기반 분석 결과 불리 SSPE 정량 합니다. 이 방법의 목적은 플라스 미드 DNA 수리 부족 하 고 능숙 하 게 포유류 세포로 페에 DPC 수리 계량 하는 것입니다. 이 분석 결과 급속 한, 양적, 매우 유연 하 고, 그리고 직접 측정 복구 활동. 이 보고서는 Dpc의 수리 공부를이 방법론의 사용에 초점을 맞추고, 하는 동안 결과 아래 모든 병 변 Taq 중 합 효소는이 방법론을 사용 하 여 공부 될 수 있다 그 블록의 그 수리를 보여 줍니다.
이 방법의 개발 뒤에 근거는 포유류 세포 DPCs 복구 메커니즘에 대 한 통찰력을 얻을 것입니다. DNA 손상의 다른 유형과 달리 Dpc는 대규모 다양 한1,2. 연구는 세포질 단백질의 수백 될 수 있다, 원칙적으로, 각 단백질에 대 한 DNA를 가교 된 covalently 세포 DNA3에 연결 될 수 있는 수많은 아미노산 사이드 체인을 증명 하고있다. 또한, 뉴클레오티드 기초에 물론 ribose 설탕4,5에 여러 위치를 포함 하 여 DNA 등뼈에는 단백질에 대 한 수많은 화학 첨부 지점 있다. 이 화학 다양성 다른 생화학 경로 Dpc의 다른 종류를 복구에 의존 수 있습니다 전망을 발생 시킵니다. 그것은 염두에 두고 SSPE 정량 분석 결과 개발 되었다이 우려와 함께 했다.
몇 가지 기법 셀룰러 DPC 복구의 분자 생물학에 대 한 통찰력을 얻기 위해 개발 되었습니다. 다음은 주요 접근 개발 된, 주요 요약 강점과 약점에 대 한 개요 각 possess입니다. 그것은 그 동안이 요약 포유류 세포 배양 시스템에 DPC 수리의 연구에 초점을 맞추고, DPC 수리의 현재 모델에 상당한 기여 한 미생물 셀 무료 시스템에 설명 하지 않습니다를 사용 하 여 강조 가치가 있다 원고입니다.
아마도 DPC 수리의 유전학에 대 한 통찰력을 얻기 위해 취할 수 있는 가장 쉬운 전략 야생 형 및 돌연변이 세포 DPCs6,7을 유발 하는 에이전트에 노출에서 관찰 된 세포 죽음에 각각 감도 평가입니다. 이 전략은 비교적 빠르고, 저렴 한, 그리고 기본적인 셀 문화 기법을 수행 하는 기능을 넘어 특수 전문 지식이 필요 하지 않습니다. 이러한 장점을 상계이 방법는 다음을 포함 한 많은 제한이 있습니다. 첫째, 분석 결과 DNA 복구를 직접 측정 하지 않습니다. 이 전략을 기본 작업 가정은 그 인코딩 관련 DNA 수 선 단백질 유전자에 돌연변이 비활성화 DNA의 축적에서 결과 손상 해당 트리거 프로그램 된 세포 죽음. 그러나, DNA 복구 비 단백질을 부호화 하는 유전자에 돌연변이, 교장에 향상 (또는 감소) xenobiotic 유도 된 세포 죽음에 세포질 감도. 둘째, Dpc를 변함없이 만드는 에이전트 다른 유형의 DNA 손상 유도 (한 가지 예외는 5-아 자-2'-deoxycytadine, 하지만이 에이전트는 또한 세포 methyltransferase 레벨8감소). 따라서, 그것은 생각할 수 있는 질문에 에이전트에 향상 된 셀룰러 과민성 결함 interstrand crosslinks 또는 다른 장애의 복구에 반영 될 수 있습니다. 셋째, 위에서 언급 한 했다 Dpc 크게 이기종 클래스를 화학 crosslinks의 다른 종류의 구성 다른 단백질 파트너와 관련 된 나타냅니다. 그 동안 이러한 장애의 하나 이상의 특수형의 수리는 특정 유전 배경에서 변경 될 수 있습니다,이 차이 하지 못할 수 있습니다 크게 죽음이 에이전트에 의해 유도 된 세포질 과민성을 변경 가능 하다. 요약 하자면,이 전략 매력적인 출발점을 나타내는 위에서 설명한 제한 DPC 복구의 속도 론을 공부 다른, 좀 더 직접적인 방법을 추구의 중요성 강조.
다양 한 관련된 접근이이 목표를 달성 하기 위해 개발 되었습니다. 예를 들어, 수 사관 '무료' DNA와 ' 단백질 바인딩 ' DNA9,,1011사이 구별 하는 방법을 개발 했습니다. 이러한 방법을 사용 하 여, Dpc 또는 다른 유전 배경의 DPC 생산 에이전트에 다음 노출의 정상 수준 비교 가능 하다. 가장 널리 사용 되는 두 가지 전략 포함 니트로 막 바인딩 전략 또는 KCl/SDS 강수량12,13를 사용 하 여 무료 DNA에서 DPC 포함 된 DNA를 분리 한다. 전 접근 셀 lysed 있으며 nitrocellulose 필터를 통해 전달. 니트로 묶는 단백질, 때문에 필터 유지 DNA 단백질 연결, 무료 DNA 통과를 허용 합니다. 사실에 근거한 SDS 단백질 없는 DNA를 바인딩하고 KCl의 추가 의해 침전 될 수 있습니다 후자의 전략 단백질 바인딩 DNA 무료 DNA에서 분리 됩니다. 따라서, DNA 단백질 연결 언바운드 DNA 솔루션에서 남아 있는 동안 불용 성 된다. DPC 포함 된 DNA 수 다음 수 quantitated 방사선된 티 미 딘을 사용 하 여 (해당 되는 경우 셀 처음 metabolically 표시 했다) 또는 Hoechst 33258 같은 DNA 선택적인 형광 성 염료. 이러한 방법은 재현할 수 있으며 적은 수의 단계를 필요. 그러나, 그들은 화학 crosslink 통해 단백질 DNA에 연결의 본질에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 또한, 그것은,이 분석 실험 DPC 거짓 불완전 복구, 즉, 분해 처리 되지 않을 수 있습니다. 쉽게 갇혀 또는 타고 난 DNA로 시 켰 던 작은 DNA-펩 티 드 crosslinks를 채 점 하 여 수리-견적 수 있습니다. 수리입니다.
혜성 분석 실험 셀14DPC 형성 시각화를 사용할 수 있습니다. 이 실험에서 Dpc의 존재는 다음 가수분해 공화국을 pretreating로 반전 될 수 있다 DNA 마이그레이션 감소 따라서, DPC 형성을 추정 하는 꼬리의 길이 사용할 수 있습니다. 그러나, 위에서 설명 했 듯이, DPC 형성 마약 꼬리 길이 변경할 수 있는 DNA 손상의 다른 종류를 만듭니다. 이 프로토콜은 또한 높은 기술 이며 전문 confocal 영상에서 훈련.
가교 에이전트15,,1617와 치료 다음과 DPC 수리 속도 론 연구 질량 분석을 사용할 수 있습니다. 이러한 실험 DPC 형성 작용 세포를 치료 하 고 biotin 캡처 또는 페 놀: 클로 프롬 (1:1) 추출 통해 Dpc를 분리. 질량 분석은 가교 된 단백질을 식별 또는 Dpc 시간이 지남에 형성의 금액을 quantitate 다음 사용할 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 생산 데이터의 특성입니다. 그러나 그것은 정확 하 게 가교 된 다음 한 xenobiotic,,이 프로토콜에 노출 되는 단백질의 종류는 비싼, 시간이 소모 되 고 crosslink 검출 될 수 있습니다. 있는 형식에 의해 제한 됩니다 카탈로그 수 있습니다.
Maizels 외. 민감한 '레이더' 개발 (DNA에 급속 한 접근 adduct 복구)을 quantitate DNA-단백질의 immunodetection 분석 결과 adducts ELISA 기반 레이더 분석 결과18,19뿐만 아니라. 이 분석 실험은 adducts 뚜렷이 셀에서 형성 하 고 새로운 단백질을 식별 하기 위해 질량 분광학에 대 한 적합 한 샘플을 생성 하는 DNA-단백질 중간체를 트래핑에 대 한 특히 유용 합니다. 이 immunodetection 분석 결과 DNA-단백질 crosslink 캡처에 항 체의 가용성에 의존 하며, 따라서 저하 DNA-펩 티 드 adducts 그 양식을 복구 하는 동안 감지 능력이 되지 않을 수 있습니다. 최근, 특정 DPC 복구 DNA 복제 및 수리20,21동안는 Dpc는 작은 펩 티 드를 proteolyzed는 DNA 의존 metalloprotease 스파르타 발견에 연결 하는 통로. 상속 된 돌연변이이 유전자에서 게놈 불안정성, 조기 노화, 간 암22이 특징인 질병 인간에서 Ruijs-Aalfs 증후군과 연결 되어 있습니다. 유전자 조작된 스파르타 유전자 결함 쥐 비슷한 고기23표시합니다.
Transcriptional 활동의 호스트 셀 재 transfected 플라스 미드 DNA 기판24,25에 정의 된 장애의 수리 공부에 사용 되었습니다. 이러한 실험, Dpc (또는 다른 유형의 DNA 병 변)을 포함 하는 플라스 미드에에서는 기자, luciferase 등의 전사를 차단, 셀으로 페. 발광 측정 촬영된 24-72 h 나중은 다음 연관 DPC 복구. 그러나, 이러한 간접 수리 분석 실험 24 h 후 transfection 이전의 복구 이벤트를 감지 할 수 있다 하 고 부분적으로 복구 된 기판의 RNA 중 합 효소 바이패스와 완전 한 복구를 구분할 수 없습니다.
위에 기술 된 방법의 각각 장점이 고 DPC 수리의 현재 모델에 기여 하고있다. 그러나, SSPE 정량 분석 결과 여러 다른 방법으로 관련 된 제한 circumvents 및 따라서 DPC 복구 메커니즘에 대 한 좀 더 구체적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. 예를 들어 SSPE 정량 분석 결과 직접 그대로 포유류 세포에서 DNA에 사이트별 Dpc의 수리를 측정할 수 있습니다. 이 메서드는 다양 하며 햄스터와 인간의 세포 transfection 다음에 수리 하기 위해 사용 되었습니다. 플라스 미드의 transfection는 경작된 한 포유류 세포의 lipofection 또는 electroporation를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그것은 또한 정의 된 Dpc의 유일한 수리, 측정 그리고 DNA 손상의 다른 형식이 아닌 대부분의 DPC 형성 대리인에 의해 유도 된 보장 합니다. SSPE 정량은 수행 하기 위해, 저렴 한, 쉽고 빠르게. 이 분석 결과 사용 하 여 얻은 결과 빠르면 2 시간 후 transfection 수리 이벤트를 감지 했습니다. 이 메서드를 사용 하 여 DPC 수리 결과 영향을 미칠 수 있는 변수는 과민 하 고 효율적인 방식으로 공부 될 수 있다. 예를 들어 DPC 수리에 전사의 역할은 아직 엄격 하 게 평가 한다. SSPE 정량 분석 결과의 유연성으로 인해이 문제를 해결 하는 DPC의 가교 사이트를 조작할 수 있습니다. 또한, DPC 베어링 플라스 미드로 복제의 근원의 소개는 DPC 수리에서 복제의 영향을 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 여러 crosslinks 여러 crosslinks 대 한 DPC의 복구에 차이 검사 하는 플라스 미드에 만들 수 있습니다. 이들은 질문을 염색체 DNA를 사용 하 여 대답 하기 어려운 것 이지만 쉽게 SSPE 정량 분석 결과 사용 하 여 해결할 수 있습니다. 전반적으로, SSPE 정량 분석 결과 정화, 알려진된 위치의 병 변을 포함 하는 그램 수량에 플라스 미드 DNA 필요 합니다. 그러나 Adducts 외에 DPC는이 분석 결과에 사용할 수 있습니다,, 병 변의 수 있어야 합니다 Taq 중 합 효소에 의해 확장을 차단.
Protocol
1입니다. DPC를 포함 하는 플라스 미드의 생성
- T4 polynucleotide 키 니 아 제 (1 µ L) 10 x 리가 버퍼 (5 µ L)에서 10 대에는 8-oxoguanine 잔류물 (20 µ L)를 포함 하는 oligonucleotide의 80 pmol 결합. 50 µ L의 총 볼륨에 도달 하 고 뜨거운된 물 욕조에 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 물을 추가 합니다.
- Phosphorylated oligonucleotide (50 µ L), 단일 가닥 DNA의 80 pmol 결합 (80 μ), 100 단위 Taq 중 합 효소 (20 µ L) 10 x Taq 반응 버퍼 (25 µ L), 100 mM ATP (20 µ L), 10 m m dNTPs (20 µ L), 코 버퍼 2 (25 µ L), 및 8 µ g BSA (20 µ L) 총 260 µ L.를 품은 15 분 뒤에 5 분 동안 37 ° C에 75 ° C에서 설정 thermocycler에서 샘플. 다음, 추가 60 U t 4의 중 합 효소 (20 µ L), 8000 U t 4 리가 (20 µ L), 100 mM ATP (20 µ L), 10 m m dNTPs (20 µ L), 코 버퍼 2 (15 µ L), 및 8 µ g BSA (20 µ L) 총 375 µ L. 37 ° C (그림 1A)에서 하룻밤 반응을 품 어.
- 50: 50 버퍼 포화 페 놀: 클로 프롬 혼합물을 만듭니다. 각 구성 요소, 믹스의 동일한 볼륨을 추가 하 고 5 분 클로 프롬 드라이브 물 두 개의 레이어를 버퍼 포화 페 놀에 대 한 21,130 x g에서 탁상 원심 분리기에서 회전: 위, 수성 층과 바닥, 유기 레이어. 뇌관 연장 반응, 믹스, 낮은, 유기 층의 375 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 21,130 x g에서 탁상 원심 분리기에서 회전.
주의: 페 놀과 클로 프롬은 유해 물질 그리고 눈 또는 피부 접촉을 피하기 위해 조치를 취해야 한다.- 원심 분리, 다음 신중 하 게 상위 레이어를 추출 하 고 염화 아세테이트 100% 에탄올의 2 권 뒤 0.3 M의 최종 농도에 추가 혼합. 최소 30 분 또는 하룻밤-20 ° C에서 솔루션을 저장 합니다.
- 상쾌한 10 분 제거를 위한 4 ° C에서 15000 x rpm 탁상 원심 분리기에 샘플을 회전 하 고 70% 에탄올의 1 mL에 펠 릿을 세척. 5 분에 대 한 제거는 상쾌한 물 100 µ L에 펠 릿을 resuspend에 4 ° C에서 15000 x rpm 탁상 원심 분리기 샘플을 회전 합니다.
- 젤 로드 염료, x 16 µ L 6와 이전 단계에서 DNA 및 34 µ L 물 50 µ L를 결합 하 고 0.8% 낮은 용융 agarose에 전기 이동 법에 따라 젤 0.5 µ g/mL ethidium 평범한 사람을 포함. 1 x TAE 버퍼에 6 h 10 cm 젤에 2 V/cm에 젤을 실행 합니다. Supercoiled 밴드 면도날과 무게 젤 조각 (그림 1A)를 사용 하 여 삭제하시오 Covalently 폐쇄, supercoiled DNA 이동에 대 한 표식으로 긍정적인 컨트롤을 실행 합니다.
주의: Ethidium 평범한 사람은 돌연 이며 주의 피부와의 접촉을 피하기 위해 해야 합니다. 또한, 플라스 미드 샘플 UV photoproducts의 형성을 줄이기 위해 자외선에 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 중요 하다.- 젤 무게의 모든 mg에 대 한 10% β-agarase 반응 버퍼를 추가 하 여 젤 슬라이스를 소화. 10 분 및 42 ° c 쿨 65 ° C에서 품 어 Β-agarase의 U 10을 추가 하 고 1 시간에 대 한 42 ° C에서 품 어.
- 다음 화, 볼륨 측정 및 실 온에서 15 분 동안 15000 x g에서 15 분 원심 분리기에 대 한 얼음에 0.3 M와 냉 기의 최종 농도에 염화 아세테이트를 추가, 상쾌한, 수집 하 고 소 프로 파 놀의 2 개를 추가. 진정-20 ° C에서 하룻밤.
- 4 ° C에서-탁상용 원심 분리기에서 15000 x rpm에서 10 분에 대 한 정화, supercoiled DNA를 원심 및 40 µ L의 물에는 펠 릿을 resuspend.
- Oxoguanine glycosylase (1 µ L) 100 mM NaCl을 포함 하는 버퍼에서의 36 pmol에 DNA의 Crosslink 12 pmol (15 µ L) (3 µ L), 1 m m MgCl2 (3 µ L), 37 ° C에서 30 µ L의 최종 볼륨을 도달 20 mM Tris HCl pH 7.0 (6 µ L), 및 10 m m 나트륨 cyanoborohydride (2 µ L) 30 분26. 가교 된 샘플의 1 µ L을 제거 하 고 데이터 가리킨 3 단계에서 PCR 분석 0 h 역할을 물 500 µ L에 희석.
2. kCl/SDS 강 수
- 가교 효율을 시각화 하려면 제한 1 µ g의 2 개의 다른 크기의 DNA 파편을 생성 하는 1 h 37 ° C에서 10 x 버퍼에서 1 μ Bsp디와 가교 된 플라스 미드를 소화.
참고: 한 조각 단백질 (4.4 kb) 가교 화 되며 다른 되지 것입니다 (2.8 kB) (그림 1B).- 모두 0.5%의 최종 농도에 SDS을 추가 반, 샘플을 분할 하 고 10 분 동안 65 ° C에서 품 어.
- KCl을 추가 (최종 농도 100 mM) 샘플 중 하나를 5 분 동안 얼음에서 알을 품고 고.
- 두 샘플 4 ° C에서 5 분 동안 12000 x g에서 원심 고 단백질 DNA12의 백분율 활용을 추정 하는 agarose 젤에는 supernatants를 실행 합니다.
참고: KCl/SDS 강수량 품질 관리, 기판 준비 하지 사용 됩니다.
3입니다. transfection 포유류 세포로
- 1 전날 transfection, 플레이트 0.5 x 106 셀/6-잘 접시에 잘. 다음 날, 혈 청 무료 문화 미디어의 300 µ L (1.6 단계)에서 DPC를 포함 하는 플라스 미드의 1.5 µ g (30 µ L) 믹스. 다른 튜브, transfection 시 약의 12 µ L 및 혈 청 무료 문화 미디어의 300 µ L을 혼합. 300 µ L 희석된 transfection 시 약의 희석된 DNA의 300 µ L를 결합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 각각 2 개의 우물의 단지 250 µ L을 추가 하 고 최소 1 시간 37 ° c.에 품 어
- 외피, 다음 미디어를 제거 하 고, 0.6 %SDS / 0.01 M EDTA의 1 mL를 추가 하 고 및 10-15 분 긁어 고무 경찰관을 사용 하 여 셀에 대 한 실 온에서 품 어 한 1.5 mL microfuge 관에 전송. 부드럽게 5 번, 5 M NaCl (1 M의 최종 농도), 반전의 200 µ L을 추가 하 고 4 ° C 하룻밤27에서 품 어.
- 샘플에서 21,130 x g 30 분 4 ° C에서-탁상용 원심 분리기에 원심, 위에서 설명한 대로 표면에 뜨는, 에탄올 침전을 수집 하 고 물의 50 µ L에서 resuspend.
4입니다. SSPE 정량
- 믹스 함께 각 시간 지점 (포함 0 h), SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 (30 µ L), 물, 27 µ L의 뇌관 (뇌관 R, 그림 2) 플라스 미드의 피해 물가에 보완 1 µ L (100 pMol) x 2에서에서 복구 된 DNA의 1 µ L. 다음과 같은 조건을 사용 하 여 PCR을 수행: 초기의 8 사이클 뒤에 90 ° C에서 10 분에 대 한 사전 용 해: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 분. 8 주기 완료에서 60 µ L (뇌관 L, 그림 2)28 총을 두 번째 뇌관의 1 µ L (100 pMol)를 추가 (시 약 정보에 대 한 재료의 표 참조).
- 믹스 1 µ L unamplified의 각 시간 점 (포함 0 h), 마스터 믹스 (30 µ L), 물, 27 µ L (100 pMol) 뇌관 각 총 60 µ L의 1 µ L x 2에서에서 DNA를 복구.
- 4.1 및 4.2 (20 µ L/음, 3 중에서) 단계에서 예제와 함께 96-잘 PCR 접시를 로드 하 고 위에서 설명한 조건을 사용 하 여 30 사이클에 대 한 정량 Pcr을 수행.
- Triplicate 샘플의 각 집합에서 CT 값을 평균입니다. 4.1 4.2 델타 각 샘플에 대 한 CT 값을 얻기에 단계에서 그 단계에서 생성 된 CT 값을 뺍니다. 어떤 배경 (에 대 한 자세한 설명은 참조 대표 결과 섹션)를 제거 하려면 델타 CT 값에서 0 h 시간 포인트를 뺍니다.
- 델타 CT 값 % 수리는 수식을 사용 하 여 변환:
Representative Results
세포질 DPC 수리를 평가 하기 위해 SSPE 정량 분석 결과 활용 하기 위해서는 높은 품질 DPC 기판 수리의 충분 한 수량 (µ g 금액) 준비 되어야 한다. 이 제품을 얻으려면, 8 oxoguanine 잔류물을 포함 하는 oligonucleotide 되었고 보완에 단련 된 단일 가닥 DNA, 뇌관 연장, 젤만 covalently, 닫힌된 원형 제품 transfections (그림에 대 한 사용은 되도록 정화 1A).이 보고서는 borohydride 트래핑은 재조합 인간 oxoguanine glycosylase와 ribose 단위 사이 화학식 crosslink 더블-좌초 원형 플라스 미드 분자에 비록 유사한 기판에 초점을 맞추고 접근 화학적으로 다양 한 DPC 기판을 사용할 수 있습니다. Oxoguanine glycosylase/borohydride 트래핑 전략은 가교 반응의 매우 높은 효율을 주어진 특히 매력적 이다. 그림 1B같이 KCl/SDS 강수량 2로 소화 했다 DPC 기판에 수행 조각을 선택적으로 그리고 양이 많게 거의 고갈 DPC를 은닉 하는 DNA 파편. 이러한 결과 플라스 미드 기질 분자의 본질적으로 100% 단백질 crosslink 포함 결론을 지원 합니다.
프로토콜 섹션에 설명 된 SSPE 정량 분석 결과 정량 DPC 수리 transfection 포유류 세포에서 다음의 %를 계산 하 여 생성 된 CT 값을 사용 합니다. 그림 2 에서 알 수 있듯이 단백질 crosslink DPC 포함 된 물가에 단련 된 'R' 뇌관 연장에서 Taq 중 합 효소를 차단 합니다. 이 분석 결과의 두 번째, 중요 한 기능이입니다 SSPE 반응 (R 뇌관을 사용 하 여)의 8 라운드의 정량 분석 결과 수행 하기 전에 손상 되지 않은 (또는 수리) DNA 이러한 SSPE 반응 동안 확장 될 것 이다, 하는 동안 다운스트림 'L' 뇌관, 바인딩 사이트를 만드는 손상 된 DNA (또는 불완전 하 게 복구 된 DNA) 하지 연장 됩니다. 따라서, SSPE eight-fold에 의해 손상 되지 않은 (또는 수리) 각 가닥의 풍부를 증가합니다. 이 즉, 복구는 SSPE 단계 정량 전에 수행 된 샘플 3 명의 단위는 SSPE 정량 (그림 2) 이전에 수행 되지 않은 동일한 샘플 얻은 그 보다 낮은 CT 값을 표시 됩니다. CT 값 ΔCT, 라고 하는 두 가지 치료에 대 한 관찰에서 3 단위 차이 반영 사실 그 8 = 23. CT 값이이 델타 세포 DNA 복구 활동은 수식을 사용 하 여 계산에 사용할 수 있습니다: %DNA 수리 = (2ΔCT /23) x 100. 제어 실험 확인 델타 CT 값 약 3의 손상 되지 않은 기판 플라스 미드 SSPE 정량 (데이터 표시 되지 않음)를 복종 되었다 때 관찰 일관 되 게 되었다.
표 1 묘사 된 DPC 포함 된 플라스 미드 기판에서 생성 된 예를 들어 CT 값 복구 중국 햄스터 폐 섬유 아 세포에서 3 h와 8 h 후 transfection (테이블 1A), 뿐만 아니라에서 시간 0 샘플 즉,, 샘플을 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 준비 했지만 하지 셀 (테이블1B)로 페. 또한 표에 ΔCT, 그리고 % 복구 값 (계산 하는 수식을 사용 하 여 2ΔCT/23 x 100)이이 샘플에서 가져온. 테이블 1A에서 볼 수 있듯이 샘플에서 계산 백분율 수리 수확 3 h 고 8 h 후 transfection는 각각 66%와 93% 있었다. 이러한 값은 다음 확인 하려면 0 h 샘플의 분석에서 얻은 그는 % 복구을 뺍니다. 표 1B 는 효율적인 가교 또는 transfection 전에 달성 하지 두 개의 다른 0 h 샘플에 대 한 CT 값을 보여 줍니다. 반면 저조한 가교 된 샘플 결과 CT 값 2.5 델타는 델타 0.8의 CT 값 가교 된 샘플 결과 효율적으로 날짜 하려면, 그것은 되지 않았습니다 정확 하 게에 0.8 배경 신호 소스를 확인 하 고 효율적으로 가교 된 0 h 샘플. 이 배경 중 자발적인 DPC 제거의 낮은 수준을 반영 하거나는 Taq의 낮은 수준으로 인해 중 합 효소 '우회' DPC 병 변 통해 합성 가능성이 크다: 매우 순화 된 단일 가닥 M13 기판에 광범위 한 실험 수행 지속적으로 나왔고 델타 약 0.8의 CT 값, 즉, 본질적으로 동일이 ' 배경 ' 확장 포함 하는 DPC 기판에서 본. 따라서, 그것은 작은 양의 'L' 뇌관 추가 될 때 이후 증폭 될 수 있는 제품의 세대에 결과 및 정량 수행 SSPE 중 'R' 뇌관의 잘못 못쓰게의 작은 정도. 날짜, PCR 상태를 조작 하 여이 배경 제거 하는 노력이이 결함을 해결 하지 못했습니다. 그러나, 위에서 설명한 빼기 전략 DPC 복구 활동의 정확한 추정을 허용 합니다. 그것은 가치 상승된 배경 가치 귀 착될 것 이다 플라스 미드에 단백질의 비효율적인 그 가교를 지적. 이것은 테이블 1B 비효율적인 단백질-DNA 가교 CT 값 높은 델타에서 시간 0에 대 한 결과에 제공 된 샘플 데이터에 그려져 있습니다. 따라서, 제어 실험 시작 transfections 및 델타 CT 값 임계값 삭제는 0.8 이상 높은 기판 이전 하지 수행 회자 됩니다. 정량 Pcr 프로토콜에서 설명 했 듯이, 각 샘플 pipetting 일관성을 보장 하기 위해 3 웰 스도 나누어져 있습니다. 이러한 복제는 해당 샘플에 대 한 CT 값을 가져오는 다음 평균 된다. 이탈 보다 ± 0.1 데이터 집합에서 제거 됩니다 복제 합니다. 모든 세 가지 복제는 각각 ± 0.1 이상 이탈, 일관 된 값은 때까지 SSPE 정량 분석 결과 칠 이다. 경험적 적어도 3 독립적인 transfections DPC 복구 효율성에 다양 한 매개 변수의 영향을 결정 하기 위해 통계 분석 대상이 될 수 있는 신뢰할 수 있는 평균 값을 얻기 위해 수행 되어야 합니다.
그림 1입니다. DPC를 포함 하는 플라스 미드의 세대. (A)는 oligonucleotide 포함 하는 8-옥 소-구 아닌 잔류물 (레드)는 단일 가닥 dna (굵은 검은 원) 단련 더블-좌초 플라스 미드 (뇌관 확장 제품 파선으로 표시)을 만드는 확장. Ethidium 평범한 사람에 전기 이동 법, 따라 supercoiled DNA (빨간색 상자)에 해당 하는 밴드는 낮은 용융 agarose 젤에서 excised 이며 β-agarase와 소화. 레인: (1) 분자량 마커, (2) 단일 가닥 DNA, (3) 이중 가닥 DNA, 뇌관 (4) 확장 샘플. (B) Oxoguanine glycosylase (약식된 hOGG1, 주황색 원으로 표시) 나트륨 cyanoborohydride 통해 8-옥 소-구 아닌 잔류물에 가교 화 이며 결과 DPC 기판 2800 기본적인 쌍, 무료 DNA 파편 및는 4400 생성 하 소화 기본적인 쌍 조각 단백질에 연결 된입니다. SDS는 다음 두 부분 중 하나는 KCl로 치료 이며 앙금 DPC 포함 된 DNA (오렌지 펠 릿으로 묘사)를 centrifuged으로 나누어져 있는 샘플에 추가 됩니다. (원심 분리기 튜브 블루 유체로 묘사)이 후자의 샘플 및 샘플 KCl에 노출 되지에서 상쾌한 젤 전기 이동 법을 복종 된다. 레인: (1) 분자량 마커, (2)-KCl, (3) + KCl. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: SSPE 정량 통해 손상 된 플라스 미드의 정량화. 플라스 미드 DNA 변성 그리고 손상 된 스트랜드 (R)에 무료 뇌관 단련 및 확장. 이 과정은 총 8 사이클에 대 한 반복 됩니다. 손상 된 기판 (맨 위), Taq 중 합 효소 DPC 병 변에 의해 차단 되 고 전체 길이 제품 가닥을 생성 하지 않습니다. 반면, 수리 기판 (아래)와 Taq 중 합 효소 입문서 나에 대 한 바인딩 사이트를 포함 하는 전장 제품 물가 생산할 예정 이다 8 주기 후 뇌관 L을 추가 하 고 주기 임계값 값 정량 Pcr를 사용 하 여 결정 됩니다. 손상 되 고 손상 되지 않은 기판에 대 한 예제 증폭 결과 DNA 정량 Pcr 및 DNA 뇌관 정량 이전 확장을 대표 하는 블루 전에 뇌관 연장 수술을 나타내는 빨간색 라인 오른쪽에 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 테이블 1A | ||||
| 시간 | -뇌관 연장 | + 뇌관 연장 | Δ CT | % 수리 |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 3 h | 23.5 | 21.1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29.4 | 26.5 | 2.9 | 93 |
| 표 1B | ||||
| 시간 | -뇌관 연장 | + 뇌관 연장 | Δ CT | 백분율 배경 |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 0 h | 15.4 | 14.6 | 0.8 | 22 |
| 0 h | 15.4 | 12.9 | 2.5 | 71 |
표 1: % 복구 SSPE 정량에서 생성 된 CT 값을 사용 하 여 계산. 3와 8 h 후 transfection V79 중국 햄스터 폐 섬유 아 세포에서 포함 하는 DPC 기판의 (A) 수리 페. (B) SSPE-0 h 샘플 하지 셀으로 페의 정량 Pcr 한 샘플의 DNA와 oxoguanine 사이 가교 반응의 효율성에서 glycosylase는 높은 (이 샘플 나왔고 낮은 델타 CT 값) 동안 다른 샘플 단백질 가교의 효율은 낮은 (이 샘플의 상대적으로 높은 델타 나왔고 CT 값)입니다. 자세한 내용은 대표 결과 의 텍스트를 참조 하십시오.
Discussion
SSPE 정량 방법 균질 성 인구를 포함 하는 단일, DPC 병 변의 복구를 검사 하 여 수많은 이점이 다른 접근을 제공 합니다. 그것은 주목할 만한 것, 단백질 및 DNA에 단백질을 연결 하는 데 사용 하는 화학 crosslink 유형의 id 뿐 아니라 그것에 DPC 병 변 도입 시퀀스 컨텍스트를 쉽게 조작 가능. 우리는 소개에 병 변에서 서식 파일 또는 활성 promotor 로커 스의 플라스 미드 다운스트림의 가닥 코딩의 DPC 수리에 영향을 탐험. 마찬가지로, 우리는 복제 HEK293T 셀으로 페의 SV40 출처를 포함 하는 M13 플라스 미드를 사용 하 여 복제의 DPC 수리에 영향을 조사 하는 과정. 분석 결과 본 직접 조치 DPC 수리, 호스트 세포 활성화는 직접 견적 복구 하지 활동24,25등 다른 전략에 반대 설명. 또한, 시스템은 강력 하 고, 민감한, 고 정량. 다른 시스템과 달리, DPC 제거를 측정,이 분석 결과 완전 한 수리 이벤트, 즉검색, DPC 병 변 제거 될 뿐만 아니라 이중 DNA의 무결성을 완벽 하 게 복원17필요 합니다. 이것은 abasic 사이트와 닉스 또는 phosphodiester 등뼈에서 원래 DPC 병 변29으로 효과적으로 분석 결과 차단 하기 때문에.
이 보고서에 의해 만들어진 borohydride 트래핑 효소 반응의 중간, DPC의 특정 형식에 초점을 맞추고 있지만 우리는 현재 다른 단백질 및 병 변이 있는 Dpc의 수리 공부 방법 개발에 단백질 결합 DNA는 ribose 위치 보다는 오히려 nucleoside 기지를 통해 발생합니다. 감소 amination를 사용 하 여, 우리는 단백질 및 펩 티 드 crosslinks 구 아닌 또는 시 토 신에 연결 된 만든 DNA 뇌관30의 기본. 이러한 oligonucleotides 동질성을 정화 하 고 supercoiled 플라스 미드 DNA-단백질 및 DNA-펩 티 드 crosslinks 포함 된 생성 하는 데 사용 했다. 이러한 반응의 효율 다소 자세히 위의 설명 oxoguanine glycosylase crosslink 접근의 상대적 감소, 하는 동안 그들은 그럼에도 불구 하 고 성공적인 되었고 야생-타입에 이러한 기판 수리 시험 허용 그리고 뉴클레오티드 절단 복구 불충분 한 포유류 세포 라인. 우리는 또한 oxoguanine 병 변 및 이전 세포 뉴클레오티드 절단 복구 기계31통해 고쳐질 줬던 합성 ribose 콜레스테롤 켤레의 수리 공부 SSPE 정량 분석 결과 사용. 그림 2 그래픽 묘사로 Taq 중 합 효소에 의해 블록 뇌관 연장, 원칙적으로, 측정 될 수 있다 SSPE 정량 분석 결과 사용 하 여 어떤 병 변의 복구.
DPC 수리의 현재 모델 제안 큰 Dpc (> 10 kDa) 더 작은 펩 티 드 병 변 제거32,,3334이전에 분해 처리를 받게 됩니다. 이 베이스에 대 한 책임 대부분 후보는 프로테아좀 인지 스파르타20,,2135,,3637, 라는 인간 세포에 있는 특정 효소 38. SSPE 정량 분석 결과 사용 하 여 이러한 프로 테아의 역할에 대 한 추가 조사를 수행할 수 있습니다. 프로테아좀 억제제와 포함 하는 DPC 기판 transfection 이전 셀을 pretreat 사용 될 수 있습니다. 또는, 스파르타 최저의 셀 라인 큰 Dpc의 베이스의 역할을 명료 하 게 손상 된 플라스 미드와 페 수 있습니다.
crosslink를 만드는 데 사용 하는 방법에 관계 없이 또는 DNA 병 변의 자연의, SSPE 정량 방법론은 비판적으로 균질 DPC 플라스 미드 기판의 상당한 금액을 생성 하는 기능에 따라 강조 가치가 있다. 이 분석 등의 정화 covalently 필수 단계, 긁어 제거 하 뇌관 연장에 따라 폐쇄 원형 플라스 미드 또는 선형 플라스 미드 분자. 되도록 모든 후속 DPC 수리 관찰 하지 닉 감독 또는 이중 가닥 휴식 감독 복구 프로세스로 인해 이러한 오염 물질을 제거 되어야 합니다. 뇌관 연장 반응에 따라 supercoiled DNA의 충분 한 수량을 얻기 위해 실패 단일 가닥 dna oligonucleotide의 비율을 변화 하 여 극복할 수 있습니다. SSPE 정량 방법에 대 한 또 다른 중요 한 단계는 플라스 미드를 단백질의 가교 효율입니다. 이 연구에는 효율적인, 효소 반응 사용 되었다 crosslink 8-옥 소-구 아닌 병 변 oxoguanine glycosylase 단백질에. 하위 최적의 가교 반응에 추가 하는 단백질의 양을 변화 하 여 향상 시킬 수 있습니다.
이 보고서에 설명 된 결과 DPC 수리 기판 받는 세포로 소개 하는 lipofection에 의존, 하는 동안 아무 이유도, 선험적으로, 다른 transfections 메서드를 고용 수 없습니다. 우리 예비 연구를 수행 하 고 관찰 그 electroporation39 를 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험에는 주목할 만한, electroporation transfection 효율 lipofection에 비해 감소 그리고 우리는 그것을 뿐만 아니라 DPC 기판의 1.5 µ g (최대 5 µ g) 캐리어 DNA 수리 데이터를 사용 하 여 필요한 발견. 전반적으로, 위에서 설명한 SSPE 정량 방법에 독점적으로 플라스 미드 DNA에 DPC 수리 검사 및 DNA 손상 응답에 새로운 통찰력을 생성 하는 혁신적인 방법을 제공 합니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회 (ES023350)에 의해 투자 되었다. Lisa Chesner 훈련 그랜트 5T32HL007741에 의해 지원 됩니다. 우리는 나탈리 아 Tretyakova (미네소타의 대학)와 Ashis Basu (코네티컷 대학) 연구소 회원 지원 및 초기 동안 기술적 조언 및이 작업의 중간 단계에 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
References
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