Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

एक सरल, तेजी से, और मात्रात्मक परख डीएनए की मरंमत को मापने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में Plasmids Transfected पर प्रोटीन Crosslinks

Published: March 5, 2018 doi: 10.3791/57413
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology, University of Minnesota

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्लाज्मिड डीएनए पर परिभाषित डीएनए-प्रोटीन crosslinks की मरंमत को बढ़ाता है । क्षतिग्रस्त plasmids प्राप्तकर्ता स्तनधारी सेल लाइनों और कम आणविक कई समय अंक पोस्ट-अभिकर्मक में काटा वजन में transfected हैं । डीएनए मरंमत कैनेटीक्स कतरा-विशिष्ट प्राइमर qPCR के बाद विस्तार का उपयोग कर quantified हैं ।

Abstract

इस विधि का उद्देश्य स्तनधारी सेल लाइनों में डीएनए-प्रोटीन crosslink (डीपीसी) की मरम्मत की कैनेटीक्स की जांच करने के लिए एक लचीला, तेजी से और मात्रात्मक तकनीक प्रदान करना है । बल्कि विश्व स्तर पर xenobiotic-प्रेरित या सहज गुणसूत्र डीपीसी हटाने के हटाने की परख, इस परख एक सजातीय, रासायनिक परिभाषित घाव विशेष रूप से एक प्लाज्मिड डीएनए सब्सट्रेट के भीतर एक साइट पर शुरू की मरंमत की जांच । महत्वपूर्ण बात, इस दृष्टिकोण रेडियोधर्मी सामग्री के उपयोग से बचा जाता है और महंगा या अत्यधिक विशेष प्रौद्योगिकी पर निर्भर नहीं है । इसके बजाय, यह मानक रिकॉमबिनेंट डीएनए प्रक्रियाओं और व्यापक रूप से उपलब्ध वास्तविक समय, मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करता है । उपयोग की रणनीति के अंतर्निहित लचीलापन को देखते हुए, crosslinked प्रोटीन के आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रासायनिक संपर्क की प्रकृति और लगाव साइट के सटीक डीएनए अनुक्रम संदर्भ इन के संबंधित योगदान का पता करने के लिए विविध किया जा सकता है डीपीसी की मरंमत की समग्र दक्षता के लिए मानदंड । इस विधि का प्रयोग, एक साइट विशिष्ट डीपीसी युक्त plasmids कोशिकाओं में transfected और कम आणविक वजन डीएनए विभिंन बार पोस्ट-अभिकर्मक पर बरामद किया गया । बरामद डीएनए तो कतरास-विशिष्ट प्राइमरी एक्सटेंशन (SSPE) प्लाज्मिड के क्षतिग्रस्त किनारा के पूरक एक प्राइमर का उपयोग करने के अधीन है । चूंकि डीपीसी घावों Taq डीएनए पोलीमरेज़ ब्लॉक, संयुक्त राष्ट्र की मरंमत डीएनए को मरंमत के अनुपात मात्रात्मक qPCR का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है । सायकल थ्रेशोल्ड (सीटी) मान संबंधित कक्ष पंक्तियों में विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रतिशत सुधार की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस SSPE-qPCR विधि का उपयोग किसी भी डीएनए adduct की मरंमत कैनेटीक्स को मात्रात्मक आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है जो Taq पोलीमरेज़ को रोकता है ।

Introduction

यहां वर्णित एक पीसीआर आधारित परख SSPE-qPCR है । इस विधि का उद्देश्य मरंमत कमी और कुशल स्तनधारी कोशिकाओं में प्लाज्मिड डीएनए transfected पर डीपीसी मरंमत मात्रा है । इस परख तेजी से है, मात्रात्मक, अत्यंत लचीला है, और सीधे उपायों की मरंमत गतिविधि । हालांकि इस रिपोर्ट DPCs की मरंमत का अध्ययन करने के लिए इस पद्धति के उपयोग पर केंद्रित है, नीचे प्रस्तुत परिणाम वर्णन है कि किसी भी घाव है कि ब्लॉक Taq पोलीमरेज़ इस पद्धति का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है की मरंमत ।

इस विधि के विकास के पीछे तर्क के माध्यम से जो स्तनधारी कोशिकाओं की मरंमत DPCs तंत्र में अंतर्दृष्टि लाभ है । डीएनए क्षति के अंय प्रकार के विपरीत, DPCs बड़े पैमाने पर1,2विविध रहे हैं । अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि सेलुलर प्रोटीन के सैकड़ों डीएनए के लिए crosslinked बन सकता है और है कि प्रत्येक प्रोटीन के लिए वहां सिद्धांत में हैं, कई एमिनो एसिड की ओर जंजीरों कि सेलुलर डीएनए से जुड़ी covalently हो सकता है3। इसके अलावा, वहां कई न्यूक्लियोटाइड ठिकानों पर के रूप में अच्छी तरह के रूप में ribose चीनी4,5पर कई पदों सहित डीएनए रीढ़ की सतह पर प्रोटीन के लिए रासायनिक लगाव अंक हैं । इस रासायनिक विविधता संभावना है कि विशिष्ट जैव रासायनिक मार्ग DPCs के विभिंन प्रकार की मरंमत पर भरोसा किया जा सकता है उठाती है । यह मन में इस चिंता के साथ था कि SSPE-qPCR की परख विकसित हो गई थी.

कई तकनीकों के लिए सेलुलर डीपीसी मरंमत के आण्विक जीवविज्ञान में अंतर्दृष्टि लाभ विकसित किया गया है । निंनलिखित प्रमुख दृष्टिकोण है कि विकसित किया गया है की एक सिंहावलोकन प्रदान करता है, प्रमुख शक्तियों और कमजोरियों का एक सारांश के साथ प्रत्येक अधिकारी । यह है कि जब इस सारांश स्तनधारी सेल संस्कृति प्रणालियों, डीपीसी की मरंमत के मौजूदा मॉडल के लिए महत्वपूर्ण योगदान में डीपीसी की मरंमत के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित करने लायक है माइक्रोबियल और सेल मुक्त सिस्टम है कि इस में चर्चा नहीं कर रहे है का उपयोग कर बनाया गया है पांडुलिपि.

शायद आसान रणनीति है कि डीपीसी की मरंमत की आनुवंशिकी में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए लिया जा सकता है कोशिका मौत के लिए संबंधित संवेदनशीलता का आकलन है जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती एजेंटों को उजागर कोशिकाओं है कि प्रेरित DPCs6,7में मनाया । इस रणनीति अपेक्षाकृत तेजी से, सस्ती है, और बुनियादी सेल संस्कृति तकनीक प्रदर्शन करने की क्षमता से परे विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है । प्रतिसंतुलन ये फायदे निम्नलिखित सहित इस दृष्टिकोण के लिए कई सीमाएं हैं । सबसे पहले, परख सीधे डीएनए की मरंमत का उपाय नहीं है । काम इस रणनीति अंतर्निहित धारणा यह है कि डीएनए क्षति का एक संचय में प्रासंगिक डीएनए की मरंमत प्रोटीन परिणाम एंकोडिंग जीन में उत्परिवर्तनों को निष्क्रिय है कि कोशिका मौत क्रमादेशित चलाता है । हालांकि, गैर एंकोडिंग जीन में उत्परिवर्तन-डीएनए मरंमत प्रोटीन, प्रिंसिपल में, xenobiotic-प्रेरित सेल मौत को बढ़ाने (या कम) सेलुलर संवेदनशीलता सकता है । दूसरा, एजेंटों कि बनाने DPCs हमेशा डीएनए क्षति के अंय प्रकार के प्रेरित (एक अपवाद है 5-aza-2'-deoxycytadine, लेकिन इस एजेंट भी सेलुलर methyltransferase स्तर घट जाती है8) । नतीजतन, यह है कि बढ़ाया सेलुलर सवाल में एजेंट के लिए अतिसंवेदनशीलता किनारा crosslinks या अंय घावों की मरंमत में दोष को प्रतिबिंबित कर सकते है गर्भ धारण है । तीसरा, के रूप में ऊपर उल्लेख किया गया था, DPCs एक बेहद विषम रासायनिक crosslinks के विभिंन प्रकार के शामिल वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं, विभिंन प्रोटीन भागीदारों को शामिल । यह संभव है कि एक या एक से अधिक उप-प्रकार के इन घावों की मरंमत एक विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि में बदला जा सकता है, यह अंतर काफी इस एजेंट द्वारा प्रेरित मौत के लिए सेलुलर अतिसंवेदनशीलता को बदलने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । सारांश में, जबकि इस रणनीति एक आकर्षक प्रारंभिक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है, ऊपर उल्लिखित सीमाओं को आगे बढ़ाने के महत्व पर प्रकाश डाला, और अधिक सीधे तरीके डीपीसी मरंमत के कैनेटीक्स अध्ययन ।

इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए कई संबंधित दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं । उदाहरण के लिए, जांचकर्ताओं ' मुक्त ' डीएनए और ' प्रोटीन बंधे ' डीएनए9,10,11के बीच अंतर करने के लिए तरीके विकसित किया है । इन तरीकों का उपयोग करना, यह संभव है DPCs के स्थिर राज्य स्तर या एक डीपीसी के लिए निंनलिखित प्रदर्शन-अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि में एजेंट के उत्पादन की तुलना । दो रणनीतियों है कि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है डीपीसी-मुक्त डीएनए से युक्त डीएनए या तो एक nitrocellulose झिल्ली बाध्यकारी रणनीति या KCl/एसडीएस वर्षण12,13का उपयोग कर अलग शामिल । पूर्व में दृष्टिकोण कोशिकाओं लीजड ड रहे है और एक nitrocellulose फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया । क्योंकि nitrocellulose बांधता प्रोटीन, फिल्टर प्रोटीन से जुड़े डीएनए, मुक्त डीएनए के माध्यम से पारित करने की अनुमति बरकरार रखती है । उत्तरार्द्ध रणनीति प्रोटीन बंधे डीएनए में इस तथ्य के आधार पर नि: शुल्क डीएनए से अलग है कि एसडीएस प्रोटीन के लिए बांध नहीं बल्कि डीएनए, और KCl के अलावा द्वारा उपजी जा सकता है । नतीजतन, प्रोटीन से जुड़े डीएनए अघुलनशील हो जाता है, जबकि असीम डीएनए समाधान में रहता है । डीपीसी युक्त डीएनए तो radiolabeled thymidine का उपयोग कर quantitated जा सकता है (यदि कोशिकाओं शुरू में चयापचय लेबल थे) या एक डीएनए द्वारा ३३२५८ Hoechst तरह फ्लोरोसेंट डाई चयनात्मक । इन विधियों reproducible है और चरणों की एक छोटी संख्या की आवश्यकता है । हालांकि, वे रासायनिक crosslink के माध्यम से जो प्रोटीन डीएनए से जुड़ा हुआ है की प्रकृति के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । इसके अलावा, यह नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है, इन परख खत्म हो सकता है झूठी मरंमत स्कोरिंग द्वारा डीपीसी की मरंमत का अनुमान है, अर्थात्, proteolytic प्रसंस्करण छोटे डीएनए-पेप्टाइड crosslinks कि के रूप में आसानी से फंस या उपजी नहीं हो सकता है, के रूप में बोनाी डीएनए मरम्मत.

धूमकेतु परख कोशिकाओं में डीपीसी गठन की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है14। इन प्रयोगों में DPCs की उपस्थिति से डीएनए माइग्रेशन घट जाता है जो proteinase बादशाह के साथ फिर से इलाज करने से उलट सकता है । इसलिए, पूंछ की लंबाई डीपीसी गठन का अनुमान लगाया जा सकता है । हालांकि, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, डीपीसी बनाने दवाओं डीएनए क्षति के अंय प्रकार है जो पूंछ लंबाई बदल सकता है बनाएं । इस प्रोटोकॉल भी उच्च तकनीकी है और फोकल इमेजिंग में विशेषज्ञता और प्रशिक्षण की आवश्यकता है ।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री crosslinking एजेंटों15,16,17के साथ उपचार के बाद डीपीसी मरंमत कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ये प्रयोग डीपीसी बनाने वाले एजेंटों के साथ कोशिकाओं का इलाज करते हैं और बायोटिन कैप्चर या phenol: क्लोरोफॉर्म (1:1) निष्कर्षण के माध्यम से DPCs को अलग करते हैं । मास स्पेक्ट्रोमेट्री तो crosslinked प्रोटीन की पहचान या समय के साथ गठन DPCs की मात्रा quantitate इस्तेमाल किया जा सकता है । इस दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ उत्पादित डेटा की प्रकृति है । यह ठीक प्रोटीन है कि एक xenobiotic के लिए जोखिम के बाद crosslinked हो के प्रकार सूची में संभव है, तथापि, इस प्रोटोकॉल महंगा है, समय लगता है, और crosslink के प्रकार है कि पता लगाया जा सकता द्वारा सीमित है ।

Maizels एट अल. एक संवेदनशील ' रडार ' (तेजी से डीएनए adduct वसूली के लिए दृष्टिकोण) परख डीएनए के quantitate immunodetection प्रोटीन adducts के रूप में अच्छी तरह से एक एलिसा आधारित रडार परख18,19के लिए विकसित की है । इन परख विशेष रूप से डीएनए में फँसाने के लिए उपयोगी प्रोटीन मध्यवर्ती कि क्षणिक कोशिकाओं में फार्म और नए प्रोटीन adducts की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त नमूने उत्पन्न. इस immunodetection परख एंटीबॉडी की उपलब्धता पर निर्भर करता है डीएनए-प्रोटीन crosslink पर कब्जा है और इसलिए, अपमानित डीएनए-पेप्टाइड adducts कि मरंमत के दौरान फार्म का पता लगाने में सक्षम नहीं हो सकता है । हाल ही में, एक विशिष्ट डीपीसी मरंमत मार्ग डीएनए प्रतिकृति और एक डीएनए पर निर्भर metalloprotease संयम से जुड़ा हुआ है जिसमें DPCs की मरंमत के दौरान छोटे पेप्टाइड्स के लिए proteolyzed कर रहे है की खोज की थी20,21। इस जीन में विरासत में मिला उत्परिवर्तनों Ruijs-Aalfs सिंड्रोम के साथ जुड़े रहे है मनुष्यों में, एक जीनोमिक अस्थिरता, समय से पहले उंर बढ़ने की विशेषता रोग, और लीवर कैंसर22। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर संयमी जीन दोष के साथ चूहों इसी तरह phenotypes23प्रदर्शन ।

transcriptional गतिविधि के मेजबान सेल पुनः सक्रियण transfected प्लाज्मिड डीएनए सब्सट्रेट24,25पर मौजूद परिभाषित घावों की मरंमत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इन प्रयोगों में, प्लाज्मिड युक्त DPCs (या अन्य प्रकार के डीएनए घावों) कि एक रिपोर्टर की प्रतिलिपि ब्लॉक, जैसे luciferase, कोशिकाओं में transfected हैं. Luminescence माप लिया 24-72 ज बाद में फिर डीपीसी मरंमत के साथ संबंधित हैं । हालांकि, इन अप्रत्यक्ष मरंमत परख 24 एच पोस्ट अभिकर्मक से पहले की मरंमत की घटनाओं का पता लगाने में असमर्थ है और आरएनए पोलीमरेज़ बाईपास आंशिक रूप से मरंमत सब्सट्रेट और पूर्ण मरंमत के बीच भेद नहीं कर सकता ।

ऊपर वर्णित तरीकों में से प्रत्येक लाभ है और डीपीसी की मरंमत के मौजूदा मॉडल के लिए योगदान दिया है । हालांकि, SSPE-qPCR परख इन अंय दृष्टिकोण के साथ जुड़े सीमाओं के कई दरकिनार और फलस्वरूप डीपीसी मरंमत तंत्र में और अधिक विशिष्ट अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, SSPE-qPCR परख सीधे साइट की मरंमत बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं में डीएनए पर विशिष्ट DPCs उपाय कर सकते हैं । इस विधि बहुमुखी है और करने के लिए उपयोग किया गया है मरंमत अभिकर्मक हंसटर और मानव कोशिका लाइनों में निंनलिखित परिणाम प्राप्त करते हैं । प्लाज्मिड के अभिकर्मक lipofection या electroporation का प्रयोग कल्चरल स्तनधारी सेल लाइंस में किया जा सकता है । यह भी सुनिश्चित करता है कि केवल परिभाषित DPCs की मरंमत मापा जाता है, और नहीं डीएनए के अंय प्रकार के सबसे डीपीसी द्वारा प्रेरित नुकसान-एजेंटों के गठन । SSPE-qPCR प्रदर्शन करने के लिए आसान है, सस्ती, और तेजी से । इस परख का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के रूप में 2 एच पोस्ट अभिकर्मक के रूप में जल्दी मरंमत घटनाओं का पता चला है । इस विधि का प्रयोग, चर कि डीपीसी मरंमत परिणामों को प्रभावित कर सकते है एक तरह से है कि संवेदनशील और कुशल है में अध्ययन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, डीपीसी की मरंमत में प्रतिलेखन की भूमिका अभी तक कड़ाई से मूल्यांकन किया जाना है । SSPE-qPCR परख के लचीलेपन के कारण, crosslinking साइट डीपीसी के इस सवाल का पता करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है । इसके अलावा, डीपीसी असर प्लाज्मिड में प्रतिकृति के एक मूल का परिचय डीपीसी मरंमत पर प्रतिकृति के प्रभाव का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, एकाधिक crosslinks प्लाज्मिड पर एक एकल डीपीसी बनाम एकाधिक crosslinks की मरंमत में अंतर की जांच करने के लिए बनाया जा सकता है । ये सवाल है कि गुणसूत्र डीएनए का उपयोग कर जवाब मुश्किल होगा रहे हैं, लेकिन आसानी से SSPE-qPCR परख का उपयोग कर संबोधित किया जा सकता है । कुल मिलाकर, SSPE-qPCR परख एक ज्ञात स्थान के घावों से युक्त माइक्रोग्राम मात्रा में शुद्ध, प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यकता है । डीपीसी के अलावा Adducts इस परख में इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, घाव Taq पोलीमरेज़ द्वारा विस्तार अवरुद्ध करने में सक्षम होना चाहिए ।

Protocol

1. डीपीसी युक्त प्लाज्मिड की पीढ़ी

  1. oligonucleotide के 80 pmol एक 8-oxoguanine अवशेषों (20 µ एल) टी-4 polynucleotide कळेनासे (1 µ एल) के 10 इकाइयों के साथ 10x ligase बफर में (5 µ एल) युक्त गठबंधन । एक गर्म पानी के स्नान में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 µ एल और गर्मी की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए पानी जोड़ें ।
    1. phosphorylated oligonucleotide (50 µ एल) का मिश्रण, एकल असहाय डीएनए के 80 pmol (80 μL), 100 इकाइयों Taq पोलीमरेज़ (20 µ एल) में 10x Taq प्रतिक्रिया बफर (25 µ एल), 100 मिमी एटीपी (20 µ एल), 10 एमएम dNTPs (20 µ एल), नेब बफर 2 (25 µ एल), और 8 µ जी BSA (20 µ एल) को कुल 260 µ एल. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के बाद 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर सेट thermocycler में नमूना । अगले, टी-4 पोलीमरेज़ के 60 यू जोड़ें (20 µ एल), 8,000 यू टी-4 ligase (20 µ एल), 100 मिमी एटीपी (20 µ एल), 10 मिमी dNTPs (20 µ एल), नेब बफर 2 (15 µ एल), और 8 µ जी BSA (20 µ एल) के लिए कुल 375 µ l को 37 ° c (चित्र 1a) पर रात भर प्रतिक्रिया देना.
  2. एक 50 के ऊपर बफर-संतृप्त phenol: क्लोरोफॉर्म मिश्रण बनाएं । प्रत्येक घटक, मिश्रण के बराबर मात्रा में जोड़ें, और स्पिन के लिए एक तालिका में शीर्ष २१,१३० x जी पर 5 min. क्लोरोफॉर्म के लिए बफर से बाहर पानी ड्राइव-संतृप्त phenol दो परतों के रूप में: एक ऊपरी, जलीय परत और एक नीचे, कार्बनिक परत । जोड़ें 375 µ एल कम, कार्बनिक परत के प्राइमर विस्तार प्रतिक्रिया, मिश्रण करने के लिए, और स्पिन एक तालिका में शीर्ष 5 मिनट के लिए २१,१३० x g पर केंद्रापसारक ।
    सावधानी: Phenol और क्लोरोफॉर्म खतरनाक पदार्थ हैं और आंखों या त्वचा के साथ संपर्क से बचने के लिए सावधानियां बरतनी चाहिए ।
    1. निंनलिखित केंद्रापसारक, ध्यान से शीर्ष परत निकालें और अमोनियम एसीटेट के साथ मिश्रण 0.3 M के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा 100% इथेनॉल के 2 संस्करणों के द्वारा पीछा किया । 30 मिनट या रात के एक ंयूनतम के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान ।
    2. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 x rpm में एक तालिका टॉप केंद्रापसारक में नमूना स्पिन । supernatant निकालें और गोली धो 70% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर में । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15,000 x rpm में एक तालिका टॉप केंद्रापसारक में नमूना स्पिन । supernatant निकालें और गोली को फिर से सस्पेंड 100 µ l पानी की ।
  3. पिछले कदम से डीएनए के 50 µ एल गठबंधन 16 µ एल 6x जेल-लोडिंग डाई, और 34 µ एल पानी और ट्रो के अधीन एक 0.8% कम पिघल agarose जेल 0.5 µ जी/एमएल ethidium ब्रोमाइड युक्त पर । 1x ताे बफर में 6 ज के लिए 10 सेमी जेल पर 2 वी/cm पर जेल चलाएं । एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर supercoiled बैंड एक्साइज और जेल स्लाइस (चित्रा 1a) वजन । एक सकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए एक मार्कर के रूप में सेवा जहां covalently बंद कर दिया, supercoiled डीएनए स्थानांतरित करता है ।
    सावधानी: Ethidium ब्रोमाइड एक mutagen है और त्वचा के साथ संपर्क से बचने के लिए सावधानियां बरती जानी चाहिए । इसके अलावा, यह समय है कि प्लाज्मिड नमूना यूवी को उजागर करने के लिए यूवी photoproducts के गठन को कम करने के लिए है कम करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    1. 10% β-agarase प्रतिक्रिया बफर जेल वजन के हर मिलीग्राम के लिए जोड़कर जेल टुकड़ा पचा । 10 मिनट के लिए 65 ° c पर मशीन और 42 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत । 1 ज के लिए 42 ° c में β-agarase और मशीन के 10 यू जोड़ें
    2. निंनलिखित मशीन, माप मात्रा और एक अंतिम एकाग्रता के लिए अमोनियम एसीटेट जोड़ने के लिए 0.3 M और ठंड बर्फ पर 15 मिनट के लिए 15,000 x जी में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए, supernatant इकट्ठा, और isopropanol के 2 मात्रा में जोड़ें । रात भर सर्द-20 डिग्री सेल्सियस ।
    3. एक मेज में 15,000 x rpm में 10 मिनट के लिए शुद्ध, supercoiled डीएनए केंद्रापसारक 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊपर केंद्रापसारक और पानी की 40 µ एल में गोली reसस्पेंड ।
  4. Crosslink 12 pmol (15 µ l) के डीएनए के 36 pmol को oxoguanine glycosylase (1 µ l) को 100 एमएम NaCl (3 µ एल) युक्त बफर में, 1 मिमी MgCl2 (3 µ एल), 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0 (6 µ एल), और 10 मिमी सोडियम cyanoborohydride (2 µ एल) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 µ एल की एक अंतिम मात्रा तक पहुँचने के लिए ३० मिन२६. crosslinked नमूना के 1 µ एल निकालें और एक 0 एच डेटा बिंदु के रूप में सेवा करने के लिए और चरण 3 में पीसीआर पर विश्लेषण करने के लिए पानी की 500 µ एल में पतला ।

2. KCl/एसडीएस वर्षण

  1. crosslinking दक्षता की कल्पना करने के लिए, प्रतिबंध डाइजेस्ट 1 µ g के साथ crosslinked प्लाज्मिड के लिए 1 μL BspDI में 37 ° c पर 1 h के लिए दो अलग आकार डीएनए टुकड़े उत्पंन करने के लिए ।
    नोट: एक टुकड़ा प्रोटीन (4.4 kb) के लिए crosslinked जाएगा और अन्य नहीं (2.8 kb) (चित्र 1b) होगा ।
    1. छमाही में नमूने को विभाजित, 0.5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए दोनों को एसडीएस जोड़ने, और 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    2. KCl जोड़ें (अंतिम एकाग्रता 100 मिमी) नमूनों में से एक को और 5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 12,000 x जी में दोनों नमूनों के केंद्रापसारक और12डीएनए के लिए प्रोटीन का प्रतिशत विकार का अनुमान करने के लिए एक agarose जेल पर supernatants चलाते हैं ।
      नोट: KCl/एसडीएस वर्षा सब्सट्रेट तैयारी नहीं, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है ।

3. स्तनधारी कोशिकाओं में अभिकर्मक

  1. 1 दिन से पहले अभिकर्मक, प्लेट 0.5 x 106 कोशिकाओं को एक 6 अच्छी तरह से थाली में/। अगले दिन, 1.5 µ g (30 µ l) डीपीसी युक्त प्लाज्मिड (कदम 1.6 से) सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया के 300 µ एल के साथ मिश्रण । एक और ट्यूब में, अभिकर्मक रिएजेंट और सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया के 300 µ एल के 12 µ एल मिश्रण । पतला डीएनए के 300 µ एल का मिश्रण 300 µ के साथ पतला अभिकर्मक रिएजेंट के एल और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । दो कुओं में से प्रत्येक के लिए परिसरों के 250 µ एल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज की एक ंयूनतम के लिए मशीन ।
  2. निंनलिखित मशीन, मीडिया को हटाने, 0.6% एसडीएस/0.01 M EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । एक रबर पुलिसकर्मी और एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब को हस्तांतरण का उपयोग कर कोशिकाओं परिमार्जन । 5 एम NaCl के 200 µ l जोड़ें (1 मीटर की अंतिम एकाग्रता), धीरे से पलटना 5 बार, और 4 ° c रात भर में गर्मी27.
  3. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक तालिका शीर्ष केंद्रापसारक में २१,१३० एक्स जी पर नमूने केंद्रापसारक, supernatant इकट्ठा, इथेनॉल के रूप में ऊपर वर्णित है, और पानी की 50 µ l में reसस्पैंड ।

4. SSPE-qPCR

  1. हर बार प्वाइंट (0 ज सहित) से बरामद डीएनए की एक साथ 1 µ l मिश्रण, 2x SYBR ग्रीन पीसीआर मास्टर मिक्स (30 µ एल), 27 पानी की µ एल, और 1 µ एल (प्राइमरी के pMol) प्लाज्मिड के नुकसान कतरा के लिए पूरक (प्राइमरी आर, चित्रा 2) । पीसीआर निंनलिखित शर्तों का उपयोग कर प्रदर्शन: 90 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्रारंभिक पूर्व पिघल, के 8 चक्र द्वारा पीछा किया: 90 ° c, 15 एस, 65 ° c, 1 min. चक्र के पूरा होने पर 8 1 µ एल (100 pMol) को दूसरी प्राइमरी के कुल 60 µ एल (प्राइमरी एल, चित्रा 2)28 (देखें सामग्री की तालिका के लिए एजेंट विवरण के लिए) जोड़ें ।
  2. प्रत्येक समय बिंदु (0 एच सहित), 2x मास्टर मिक्स (30 µ एल), 27 µ एल पानी की, और 1 µ एल के एक (100 pMol) के कुल 60 µ एल के लिए एक से अधिक अंक से बरामद डीएनए के 1 µ एल मिश्रण ।
  3. कदम 4.1 और 4.2 से नमूनों के साथ एक 96-well पीसीआर प्लेट लोड (20 µ एल/ठीक है, तपसिल में) और ऊपर वर्णित शर्तों का उपयोग 30 चक्र के लिए qPCR प्रदर्शन ।
  4. औसत तपसिल नमूनों के प्रत्येक सेट से सीटी मूल्यों । प्रत्येक नमूने के लिए डेल्टा सीटी मान प्राप्त करने के लिए चरण 4.2 में उन से चरण 4.1 में उत्पन्न सीटी मान घटाना. किसी भी पृष्ठभूमि को निकालने के लिए डेल्टा सीटी मान से 0 h समय बिंदु घटाना ( प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग विस्तृत विवरण के लिए देखें) ।
  5. डेल्टा सीटी मान सूत्र का उपयोग कर प्रतिशत सुधार में कनवर्ट करें:
    Equation

Representative Results

आदेश में SSPE-qPCR परख का उपयोग करने के लिए सेलुलर डीपीसी मरंमत का आकलन करने के लिए, एक पर्याप्त मात्रा (µ g मात्रा) उच्च गुणवत्ता वाले डीपीसी मरंमत सब्सट्रेट तैयार किया जाना चाहिए । इस उत्पाद को प्राप्त करने के लिए, एक 8-oxoguanine अवशेषों से युक्त एक oligonucleotide पूरक एकल-असहाय डीएनए, प्राइमरी विस्तारित करने के लिए annealed था, और यह सुनिश्चित करने के लिए शुद्ध जेल केवल covalently, बंद परिपत्र उत्पाद transfections के लिए इस्तेमाल किया गया था (चित्रा 1a). इस रिपोर्ट में उन सब्सट्रेट्स पर केंद्रित है जिनमें borohydride-ट्रैपिंग को रिकॉमबिनेंट ह्यूमन oxoguanine glycosylase के बीच एक आबंध crosslink बनाने और दोहरे-असहाय परिपत्र ribose अणु पर एक प्लाज्मिड इकाई का प्रयोग किया जाता है, हालांकि अनुरूप दृष्टिकोण रासायनिक विविध डीपीसी सब्सट्रेट प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । oxoguanine glycosylase/borohydride फँसाने की रणनीति विशेष रूप से crosslinking प्रतिक्रिया की अत्यंत उच्च दक्षता दी आकर्षक है. के रूप में चित्रा 1bमें दिखाया गया है, KCl/एसडीएस एक डीपीसी सब्सट्रेट है कि दो टुकड़ों में चुन पचा गया था पर प्रदर्शन किया और लगभग मात्रात्मक डीएनए डीपीसी बंदरगाह टुकड़ा समाप्त हो गया । इन परिणामों के निष्कर्ष का समर्थन है कि मूलतः प्लाज्मिड सब्सट्रेट अणुओं के 100% एक प्रोटीन crosslink होते हैं ।

SSPE-qPCR प्रोटोकॉल खंड में वर्णित परख सीटी qPCR द्वारा उत्पंन मूल्यों को डीपीसी की मरंमत के प्रतिशत स्तनधारी कोशिकाओं में अभिकर्मक निंनलिखित की गणना का इस्तेमाल करता है । के रूप में चित्रा 2 दिखाता है, प्रोटीन crosslink ब्लॉक Taq पोलीमरेज़ ' आर ' प्राइमर annealed के विस्तार से डीपीसी युक्त किनारा । एक दूसरे, इस परख के महत्वपूर्ण विशेषता SSPE प्रतिक्रियाओं के आठ दौर के शामिल है (आर प्राइमर का प्रयोग) से पहले qPCR परख प्रदर्शन । जबकि नुकसान (या मरंमत) डीएनए इन SSPE प्रतिक्रियाओं के दौरान बढ़ाया जाएगा, बहाव ' एल ' प्राइमर, क्षतिग्रस्त डीएनए (या पूरी तरह से डीएनए की मरंमत) के लिए एक बाध्यकारी साइट का निर्माण नहीं बढ़ाया जाएगा । नतीजतन, SSPE हर नुकसान की बहुतायत बढ़ जाती है (या मरंमत) आठ गुना से कतरा । इसका अर्थ यह है कि सुधारे गए नमूनों में जो SSPE चरण qPCR करने से पहले किया गया है जो एक समान नमूना जिसमें SSPE qPCR करने के लिए पूर्व (चित्र 2) नहीं किया गया था के लिए प्राप्त की तुलना में तीन इकाइयाँ कम है एक सीटी मान प्रदर्शित करेगा । सीटी मूल्यों में तीन यूनिट अंतर दो उपचार के लिए मनाया, ΔCT के रूप में भेजा, तथ्य यह है कि 8 = 23को दर्शाता है । इस डेल्टा सीटी मूल्य सूत्र का उपयोग करके सेलुलर डीएनए मरंमत गतिविधि की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: प्रतिशत डीएनए मरंमत = (2Δसीटी/23) एक्स 100 । नियंत्रण प्रयोगों की पुष्टि की है कि लगभग 3 के एक डेल्टा सीटी मूल्य लगातार जब नुकसान सब्सट्रेट plasmids SSPE-qPCR (डेटा दिखाया नहीं) के अधीन थे मनाया गया था ।

तालिका 1 उदाहरण सीटी मूल्यों है कि डीपीसी युक्त प्लाज्मिड सब्सट्रेट है कि चीनी हंसटर फेफड़ों fibroblasts 3 एच और 8 एच पोस्ट-अभिकर्मक (टेबल 1a), साथ ही समय शूंय नमूनों से बरामद किए गए से उत्पंन किया गया दर्शाया गया है, यानी, नमूने जो प्रोटोकॉल अनुभाग में बताए गए अनुसार तैयार किए गए थे, लेकिन कक्षों (तालिका1b) में नहीं transfected । तालिका भी ΔCT प्रदान करता है, और प्रतिशत सुधार मान (सूत्र का उपयोग कर परिकलितसीटी/इन नमूनों से प्राप्त 23 x 100). के रूप में तालिका 1aमें सचित्र, प्रतिशत की मरंमत नमूनों से गणना 3 घंटे और 8 घंटे के बाद अभिकर्मक 66% और 93%, क्रमशः था । ये मान तो प्रतिशत सुधार निर्धारित करने के लिए 0 h नमूने के विश्लेषण से प्राप्त से घटाया है । तालिका 1b दो अलग 0 एच नमूनों में कुशल crosslinking था या अभिकर्मक से पहले प्राप्त नहीं था के लिए सीटी मूल्यों को दर्शाया गया है । कुशलता से crosslinked नमूना एक डेल्टा सीटी मान के परिणामस्वरूप 0.8 जबकि एक खराब crosslinked नमूना के परिणामस्वरूप एक डेल्टा सीटी 2.5 का मान । तिथि करने के लिए, यह ठीक से कुशलता से crosslinked 0 एच नमूना में 0.8 पृष्ठभूमि संकेत के स्रोत का निर्धारण करने के लिए संभव नहीं किया गया है । यह संभावना नहीं है कि इस पृष्ठभूमि या तो सहज डीपीसी हटाने के एक निम्न स्तर को दर्शाता है, या डीपीसी घाव के माध्यम से Taq ' पोलीमरेज़ बाईपास संश्लेषण के एक निम्न स्तर के कारण है: अत्यधिक शुद्ध एकल असहाय M13 सब्सट्रेट पर प्रदर्शन व्यापक प्रयोग लगातार लगभग 0.8 के एक डेल्टा सीटी मूल्य, यानी, अनिवार्य रूप से इस ' पृष्ठभूमि ' के लिए समान विस्तार डीपीसी युक्त सब्सट्रेट में देखा उपज । नतीजतन, यह संभावना है कि वहां SSPE के दौरान गलत-' आर प्राइमरी की एक छोटी सी डिग्री है कि उत्पाद की एक छोटी राशि है कि बाद में जब ' एल ' प्राइमर से परिलक्षित हो सकता है की पीढ़ी में परिणाम है जोड़ा है, और qPCR प्रदर्शन किया । इस पृष्ठभूमि को खत्म करने के प्रयास पीसीआर शर्तों जोड़ तोड़ है, तिथि करने के लिए, इस दोष उपाय करने में विफल रहा है । तथापि, घटाव रणनीति ऊपर वर्णित डीपीसी मरंमत गतिविधि का सही आकलन परमिट । यह ध्यान देने योग्य है कि प्लाज्मिड पर प्रोटीन की अकुशल crosslinking एक उंनत पृष्ठभूमि मूल्य में परिणाम होगा लायक है । यह नमूना तालिका 1b में उपलब्ध कराए गए डेटा में दिखाया गया है, जहां अक्षम प्रोटीन-डीएनए crosslinking समय 0 के लिए एक उच्च डेल्टा सीटी मूल्य के परिणामस्वरूप । इसलिए, नियंत्रण प्रयोगों हमेशा की शुरुआत करने से पहले प्रदर्शन कर रहे हैं transfections और सब्सट्रेट डेल्टा सीटी मान के साथ ऊपर ऊंचा 0.8 थ्रेशोल्ड स्तर खारिज कर रहे हैं. के रूप में qPCR प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, प्रत्येक नमूने pipetting निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए 3 कुओं में बांटा गया है । ये प्रतिकृति तो उस नमूने के लिए सीटी मान प्राप्त करने के लिए औसत रहे हैं । प्रतिकृति है कि अधिक से विचलित ± 0.1 डेटा सेट से समाप्त कर रहे हैं । यदि सभी तीन प्रतिकृतियां एक दूसरे से अधिक ± 0.1 विचलित, SSPE-qPCR परख जब तक संगत मूल्यों को प्राप्त कर रहे है पुनः किया जाता है । अनुभव से पता चलता है कि ंयूनतम 3 स्वतंत्र transfections को विश्वसनीय औसत मूल्यों है कि तब सांख्यिकीय विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है डीपीसी की मरंमत दक्षता पर विभिंन मापदंडों के प्रभाव का निर्धारण प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1. एक डीपीसी युक्त प्लाज्मिड की पीढ़ी । (क) एक oligonucleotide युक्त एक 8-oxo-guanine अवशेषों (लाल) एकल-असहाय डीएनए (बोल्ड काले सर्कल) को annealed है और डबल-कतरा प्लाज्मिड (प्राइमर विस्तार उत्पाद डैश्ड लाइन द्वारा संकेत) बनाने के लिए विस्तारित । ethidium ब्रोमाइड में ट्रो के बाद, supercoiled डीएनए (लाल बॉक्स) के लिए इसी बैंड एक कम पिघल agarose जेल से आबकारी और β-agarase के साथ पचा रहा है । गलियाँ: (१) आणविक भार मार्कर, (२) एकल-असहाय डीएनए, (३) डबल-कतरा डीएनए, (४) प्राइमरी विस्तारित नमूना. (ख) Oxoguanine glycosylase (संक्षिप्त hOGG1, एक नारंगी चक्र के रूप में चित्रित) सोडियम oxo के माध्यम से 8-guanine-cyanoborohydride अवशेषों के लिए crosslinked है और जिसके परिणामस्वरूप डीपीसी सब्सट्रेट एक २,८०० आधार जोड़ी उत्पन्न करने के लिए पचा, नि: शुल्क डीएनए टुकड़ा और एक ४,४०० आधार जोड़ी प्रोटीन से जुड़ी टुकड़ा । एसडीएस नमूना है जो फिर दो भागों, जिनमें से एक KCl के साथ इलाज किया जाता है और तलछट डीपीसी से युक्त डीएनए (एक नारंगी गोली के रूप में चित्रित) में विभाजित है में जोड़ा है । इस बाद के नमूने से supernatant (के रूप में नीले तरल पदार्थ ट्यूब में चित्रित) और KCl को उजागर नहीं नमूना जेल ट्रो के अधीन हैं । गलियाँ: (१) आणविक भार मार्कर, (२)-KCl, (३) + KCl. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: SSPE-qPCR के माध्यम से क्षतिग्रस्त प्लाज्मिड के ठहराव. प्लाज्मिड डीएनए विकृत और क्षतिग्रस्त किनारा (आर) के लिए एक पुस्तक पूरक है annealed और बढ़ाया । इस प्रक्रिया को कुल 8 चक्रों के लिए दोहराया जाता है । एक क्षतिग्रस्त सब्सट्रेट (ऊपर) के साथ, Taq पोलीमरेज़ डीपीसी घावों से अवरुद्ध है और पूर्ण लंबाई उत्पाद किस्में का उत्पादन नहीं होगा । इसके विपरीत, एक मरंमत सब्सट्रेट (नीचे) के साथ, Taq पोलीमरेज़ पूर्ण लंबाई उत्पाद का उत्पादन होगा किस्में प्राइमर एल के लिए बाध्यकारी साइट युक्त । 8 चक्र के बाद, प्राइमर एल जोड़ा जाता है, और चक्र थ्रेसहोल्ड मूल्यों qPCR का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं. उदाहरण क्षतिग्रस्त और नुकसान सब्सट्रेट के लिए प्रवर्धन परिणामों को लाल डीएनए का प्रतिनिधित्व लाइन के साथ सही पर सचित्र है कि qPCR और नीले डीएनए का प्रतिनिधित्व करने से पहले qPCR से पहले बढ़ाया नहीं था प्राइमर विस्तार किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1a
समय -प्राइमरी एक्सटेंशन + प्राइमरी एक्सटेंशन Δ सीटी प्रतिशत मरंमत
(2ΔCT/23x 100)
3 ज 23.5 २१.१ 2.4 66
8 ज २९.४ 26.5 2.9 93
तालिका 1b
समय -प्राइमरी एक्सटेंशन + प्राइमरी एक्सटेंशन Δ सीटी प्रतिशत पृष्ठभूमि
(2ΔCT/23x 100)
0 ज 15.4 वशेष 0.8 22
0 ज 15.4 12.9 2.5 ७१

तालिका 1: SSPE-qPCR से जेनरेट किए गए सीटी मानों का उपयोग करके प्रतिशत सुधार परिकलित कर रहा है. (क) V79 चीनी हंसटर फेफड़े fibroblasts 3 एच और 8 एच के बाद अभिकर्मक में एक डीपीसी युक्त सब्सट्रेट transfected की मरंमत । (B) SSPE-qPCR 0 h के नमूने कक्षों में नहीं transfected । एक नमूना में डीएनए और oxoguanine glycosylase के बीच crosslinking प्रतिक्रिया की दक्षता उच्च था (यह नमूना एक कम डेल्टा सीटी मूल्य झुकेंगे) जबकि अन्य नमूने में प्रोटीन crosslinking की दक्षता कम था (इस नमूने एक अपेक्षाकृत उच्च डेल्टा झुकेंगे सीटी मान). विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम का पाठ देखें ।

Discussion

SSPE-qPCR विधि एक समरूप जनसंख्या युक्त एक एकल, परिभाषित डीपीसी घावों की मरंमत की जांच करके अंय दृष्टिकोण पर कई लाभ प्रदान करता है । यह उल्लेखनीय है कि प्रोटीन की पहचान को नियंत्रित करने और डीएनए के लिए प्रोटीन से कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया रासायनिक crosslink के प्रकार के अलावा, यह आसानी से अनुक्रम संदर्भ जिसमें डीपीसी घाव पेश किया है हेरफेर करने के लिए संभव है । हम या तो टेंपलेट या एक सक्रिय मोटर लोकस के एक प्लाज्मिड बहाव के किनारा कोडिंग पर घाव शुरू करने की डीपीसी मरंमत पर प्रभाव का पता लगाया है । इसी तरह, हम एक M13 प्लाज्मिड का उपयोग कर प्रतिकृति की मरंमत पर प्रभाव की जांच की प्रक्रिया में है HEK293T कोशिकाओं में प्रतिकृति transfected के एक SV40 मूल युक्त । परख बताया इस के साथ साथ सीधे डीपीसी मरंमत के उपाय, जैसे मेजबान सेल पुनर्सक्रियन कि परोक्ष रूप से मरंमत गतिविधि24,25का अनुमान के रूप में अंय रणनीतियों के खिलाफ । इसके अलावा, प्रणाली मजबूत, संवेदनशील, और मात्रात्मक है । अंय प्रणालियों, जो डीपीसी हटाने के उपाय के विपरीत, इस परख केवल पूरी मरंमत की घटनाओं का पता लगाता है, यानी, यह केवल कि डीपीसी घावों को हटा दिया जाना चाहिए, लेकिन है कि द्वैध डीएनए की अखंडता पूरी तरह से17बहाल हो । इसका कारण यह है abasic साइटों और निक या phosphodiester रीढ़ में टूटता है परख ब्लॉक के रूप में प्रभावी रूप से मूल डीपीसी घाव29के रूप में ।

हालांकि इस रिपोर्ट के एक विशेष प्रकार की डीपीसी पर केंद्रित है, जो एक एंजाइम रिएक्शन मध्यवर्ती के borohydride फँसाने के द्वारा बनाई गई थी, हम वर्तमान में अंय प्रोटीन और घावों जिसमें प्रोटीन के संबंध को शामिल DPCs की मरंमत का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण विकसित कर रहे है डीएनए nucleoside आधार के माध्यम से होता है, बजाय ribose स्थिति से । प्रतिवाहिनी अमीना का उपयोग कर, हमने प्रोटीन और पेप्टाइड crosslinks एक डीएनए प्राइमरी30के guanine या cytosine आधार से जुड़ा बनाया है । ये oligonucleotides सजातीयता को शुद्ध कर रहे थे और डीएनए-प्रोटीन और डीएनए-पेप्टाइड crosslinks युक्त supercoiled plasmids उत्पन्न करते थे. हालांकि इन प्रतिक्रियाओं की दक्षता कुछ हद तक oxoguanine glycosylase crosslink दृष्टिकोण की है कि इसके बाद के संस्करण विस्तार से वर्णित के सापेक्ष कम है, वे फिर भी सफल रहे थे और जंगली में इन सब्सट्रेट की मरंमत प्रकार की परीक्षा की अनुमति और न्यूक्लियोटाइड की मरंमत की कमी स्तनधारी सेल लाइनों । हमने oxoguanine घावों और एक सिंथेटिक ribose-कोलेस्ट्रॉल संयुग्मी की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए SSPE-qPCR की परख का भी उपयोग किया है, जिसे पहले सेलुलर न्यूक्लियोटाइड एक्साइज रिपेयर मशीनरी के माध्यम से मरम्मत के लिए दिखाया गया था31. के रूप में चित्रा 2 रेखांकन, किसी भी घाव की मरंमत कि ब्लॉक प्राइमर विस्तार Taq पोलीमरेज़ द्वारा, सिद्धांत रूप में, SSPE-qPCR परख का उपयोग कर मापा जा सकता है ।

डीपीसी मरम्मत के वर्तमान मॉडल सुझाव है कि बड़े DPCs (> 10 केडीए) को हटाने से पहले छोटे पेप्टाइड घाव करने के लिए proteolytic प्रसंस्करण के अधीन हैं32,33,34. सबसे अधिक संभावना इस प्रोटियोलिसिस के लिए जिंमेदार उंमीदवारों proteasome या मानव संयमी20,21,35,36,37, में नामित कोशिकाओं में एक विशेष चिढ़ाते हैं 38. इन की भूमिकाओं में आगे की जांच के लिए SSPE-qPCR परख का उपयोग कर आयोजित किया जा सकता है । Proteasome अवरोधकों डीपीसी युक्त सब्सट्रेट के साथ अभिकर्मक करने से पहले कोशिकाओं का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, संयमी पछाड़ना सेल लाइनों को क्षतिग्रस्त plasmids के साथ transfected बड़ा प्रोटियोलिसिस के DPCs में अपनी भूमिका स्पष्ट जा सकता है ।

crosslink या डीएनए घावों की प्रकृति के बनाने के लिए इस्तेमाल किया विधि के बावजूद, यह SSPE-qPCR पद्धति गंभीर रूप से सजातीय डीपीसी-प्लाज्मिड सब्सट्रेट की पर्याप्त मात्रा में उत्पन्न करने की क्षमता पर निर्भर है कि तनाव के लायक है । इस विश्लेषण के लिए आवश्यक कदम covalently की शुद्धि, बंद-परिपत्र प्लाज्मिड निंनलिखित प्राइमर विस्तार के लिए किसी भी निक या रैखिक प्लाज्मिड अणुओं को खत्म करने में शामिल हैं । इन संदूषणों को सुनिश्चित करने के लिए समाप्त किया जाना चाहिए कि किसी भी बाद डीपीसी की मरंमत मनाया निक निर्देशित या डबल-किनारा तोड़-निर्देशित मरंमत प्रक्रियाओं के कारण नहीं है । supercoiled डीएनए की पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने के लिए विफलता निम्न प्राइमरी एक्सटेंशन प्रतिक्रियाओं को oligonucleotide का अनुपात अलग से एकल-असहाय डीएनए से दूर किया जा सकता है । SSPE-qPCR विधि के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम, प्लाज्मिड के लिए प्रोटीन की crosslinking क्षमता है । इस अध्ययन में, एक कुशल, एंजाइमी प्रतिक्रिया एक 8-oxo-guanine घावों को oxoguanine glycosylase प्रोटीन crosslink के लिए इस्तेमाल किया गया था । उप इष्टतम crosslinking की प्रतिक्रिया में जोड़ा प्रोटीन की मात्रा में अलग से सुधार किया जा सकता है ।

हालांकि इस रिपोर्ट में वर्णित परिणाम lipofection पर भरोसा करने के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में डीपीसी मरंमत सब्सट्रेट परिचय, वहां कोई कारण नहीं है, एक प्राथमिकताओं, अंय transfections तरीकों कार्यरत नहीं किया जा सकता है । हम प्रारंभिक अध्ययन किया है और कहा कि electroporation39 भी इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान देने योग्य बात है कि हमारे अनुभव में, electroporation अभिकर्मक क्षमता lipofection की तुलना में कम है, और हम यह आवश्यक वाहक डीएनए का उपयोग करने के लिए पाया (5 µ g) के अलावा में 1.5 µ जी की डीपीसी सब्सट्रेट मरंमत डेटा प्राप्त करने के लिए । कुल मिलाकर, SSPE-qPCR विधि ऊपर वर्णित एक अभिनव तरीका है विशेष रूप से प्लाज्मिड डीएनए पर डीपीसी की मरंमत की जांच और डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में नई अंतर्दृष्टि उत्पंन प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (ES023350) द्वारा वित्त पोषित किया गया । लिसा Chesner प्रशिक्षण अनुदान 5T32HL007741 द्वारा समर्थित है । हम नतालिया Tretyakova (मिनेसोटा विश्वविद्यालय) और आशीष बसु (कनेक्टिकट विश्वविद्यालय) और उनके इस काम के प्रारंभिक और मध्यवर्ती चरणों के दौरान समर्थन और तकनीकी सलाह के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-oxoguanine modified oligo Midland Certified Reagent Company NA Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’
T4 PNK NEB M0201S
Single-stranded M13 NEB N4040S
Taq polymerase NEB M0267L
ATP, 100mM Thermo Scientific R0441
dNTP Mix, 10mM each Thermo Scientific R0192
BSA NEB B9001S
T4 polymerase NEB M0203L
T4 ligase NEB M0202L
β-agarase NEB M0392S
Oxoguanine glycosylase 1 NEB M0241S
SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems 4309155 green PCR master mix
Primer R UMN Genomic Center NA 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’
Primer L UMN Genomic Center NA 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’
Lipofectamine Reagent Invitrogen 18324-012 transfection reagent 
BspD1 NEB R0557S
NEB buffer 2 NEB B7002S
StepOnePlus Real Time PCR System Applied Biosystems 4376600
UltraPure Buffer-Saturated Phenol Invitrogen 15513-047
Chloroform, reagent ACS, spectro grade ACROS 40463-5000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
  2. Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
  3. At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
  4. Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
  5. Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
  6. Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
  7. Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
  8. Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
  9. Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
  10. Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
  11. Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
  12. Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
  13. Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
  14. Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
  15. Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
  16. Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
  17. Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
  18. Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
  19. Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).
  20. Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
  21. Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
  22. Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
  23. Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
  24. Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
  25. Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
  26. Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
  27. Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
  28. Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
  29. Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
  30. Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
  31. George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
  32. Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
  33. Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
  34. Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
  35. Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
  36. Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
  37. Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
  38. Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
  39. Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).

Tags

जेनेटिक्स इश्यू 133 डीएनए-प्रोटीन crosslinks डीएनए रिपेयर मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन 8-oxoguanine ह्यूमन oxoguanine glycosylase Taq पोलीमरेज़
एक सरल, तेजी से, और मात्रात्मक परख डीएनए की मरंमत को मापने के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में Plasmids Transfected पर प्रोटीन Crosslinks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chesner, L. N., Campbell, C. A… More

Chesner, L. N., Campbell, C. A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (133), e57413, doi:10.3791/57413 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter