Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di quantificare la riparazione di definiti legami incrociati della DNA-proteina il DNA del plasmide. Lesi plasmidi sono transfected nelle linee cellulari di mammifero destinatario e basso peso molecolare raccolte a più punti di tempo post-transfezione. Cinetica di riparazione del DNA sono quantificati utilizzando primer specifici strand estensione seguita da qPCR.
Abstract
Lo scopo di questo metodo è quello di fornire una tecnica flessibile, rapida e quantitativa per esaminare la cinetica della riparazione di crosslink (DPC) della DNA-proteina in linee cellulari di mammifero. Piuttosto che a livello globale analizzante rimozione di rimozione di DPC cromosomica spontanea o indotta da xenobiotici, questo test esamina la riparazione di una lesione omogenea, chimicamente definita precisamente introdotta in un sito all'interno di un substrato di DNA del plasmide. Cosa importante, questo approccio evita l'uso di materiali radioattivi e non è dipendente dalla tecnologia costosa o altamente specializzate. Invece, si basa su procedure standard del DNA ricombinante e strumentazione (qPCR) reazione a catena della polimerasi in tempo reale, quantitativi ampiamente disponibili. Data l'intrinseca flessibilità della strategia utilizzata, le dimensioni della proteina reticolato, così come la natura del collegamento chimico e il DNA preciso contesto di sequenza del sito allegato può essere variata per affrontare i rispettivi contributi di questi parametri per l'efficienza complessiva del DPC di riparazione. Utilizzando questo metodo, plasmidi contenenti un DPC site-specific erano transfected nelle cellule e basso peso molecolare DNA recuperato in vari momenti post-transfezione. DNA recuperato viene sottoposta a estensione dell'iniettore specifico strand (SSPE) utilizzando un primer complementare al filamento danneggiato del plasmide. Dal DPC lesione blocchi Taq DNA polimerasi, il rapporto del DNA riparato a ONU-riparato può essere valutato quantitativamente mediante qPCR. Valori di soglia (CT) del ciclo vengono utilizzati per calcolare % riparazione a vari intervalli di tempo nelle linee cellulari rispettivi. Questo metodo di SSPE-qPCR può essere utilizzato anche per valutare quantitativamente la riparazione cinetica di qualsiasi DNA del complesso quello polimerasi di Taq blocchi.
Introduction
Descritto nel presente documento è un'analisi PCR-basata definita SSPE-qPCR. Lo scopo di questo metodo è quello di quantificare la riparazione DPC il plasmide che DNA transfected nelle cellule di mammifero riparazione carenti e competente. Questo test è rapido, quantitativa, estremamente flessibile e direttamente misure ripristino l'attività. Mentre questo rapporto si concentra sull'uso di questa metodologia per lo studio di riparazione della DPC, risultati presentati qui di seguito illustrano che la riparazione di qualsiasi lesione che blocca Taq polimerasi possono essere studiata utilizzando questa metodologia.
La spiegazione razionale dietro lo sviluppo di questo metodo è quello di approfondire i meccanismi attraverso i quali le cellule di mammiferi ripristino DPC. A differenza di altri tipi di danno del DNA, le DPC sono massicciamente diversificata1,2. Gli studi hanno dimostrato che centinaia di proteine cellulari può diventare reticolato di DNA e che per ogni proteina ci sono, in linea di principio, numerose catene laterali dell'amminoacido che potrebbero affezionarsi covalentemente al DNA cellulare3. Inoltre, ci sono numerosi punti di attacco chimico per proteine sulla spina dorsale del DNA, compreso parecchie posizioni sulle basi del nucleotide, così come il ribosio zucchero4,5. Questa diversità chimica genera la prospettiva che le vie biochimiche distinte possono essere invocate per riparare diversi tipi di DPC. Fu con questa preoccupazione in mente che il dosaggio di SSPE-qPCR è stato sviluppato.
Diverse tecniche sono state sviluppate per guadagnare la comprensione nella biologia molecolare di riparazione cellulare DPC. Di seguito viene fornita una panoramica dei principali approcci che sono stati sviluppati, con una sintesi dei principali punti di forza e di debolezza ogni possesso. Vale la pena sottolineare che mentre questa sintesi si concentra sugli studi di riparazione DPC in sistemi di coltura di cellule di mammifero, un contributo significativo al modello attuale di riparazione DPC è stato realizzato con sistemi microbici e senza cellula che non vengono trattati in questo manoscritto.
Forse la strategia più semplice che possa essere adottata per approfondire la genetica di riparazione DPC è quello di valutare la rispettiva sensibilità alla morte cellulare osservata in cellule wild-type e mutanti, esposte agli agenti che inducono le DPC6,7. Questa strategia è relativamente veloce, poco costoso e non richiede competenze specialistiche oltre la capacità di eseguire tecniche di coltura cellulare di base. Controbilanciare questi vantaggi sono numerose limitazioni di questo approccio tra cui i seguenti. In primo luogo, il test non misura direttamente la riparazione del DNA. L'ipotesi di lavoro alla base di questa strategia sono che mutazioni nei geni che codificano proteine di riparazione del DNA pertinenti inattivanti provoca un accumulo di DNA danneggia che trigger la morte programmata delle cellule. Tuttavia, le mutazioni nei geni che codificano proteine di riparazione di DNA non potrebbero, in linea di principio, che permettono di migliorare (o ridurre) sensibilità cellulare alla morte cellulare indotta da xenobiotici. In secondo luogo, gli agenti che creano le DPC invariabilmente indurre altri tipi di danno del DNA (l'unica eccezione è 5-aza-2'-deoxycytadine, ma questo agente impoverisce anche cellulare metiltransferasi livelli8). Di conseguenza, è concepibile che cellulare avanzata ipersensibilità all'agente in questione possa riflettere i difetti di riparazione del interstrand reticolazioni o altre lesioni. In terzo luogo, come è stato accennato in precedenza, DPC rappresentano una classe notevolmente eterogenea composta da diversi tipi di legami chimici incrociati, che coinvolgono partner di diverse proteine. È possibile che, mentre la riparazione di uno o più sottotipi di queste lesioni può essere alterati in un particolare background genetico, questa differenza potrebbe non essere sufficiente ad alterare significativamente cellulare ipersensibilità alla morte indotta da questo agente. In sintesi, mentre questa strategia rappresenta un interessante punto di partenza, le limitazioni di cui sopra evidenziano l'importanza di perseguire altri metodi più diretti per studiare la cinetica di riparazione DPC.
Un numero di approcci correlati è stato sviluppato per raggiungere questo obiettivo. Per esempio, gli investigatori hanno sviluppato metodi per distinguere tra DNA 'libero' e 'protein-bound' DNA9,10,11. Utilizzando questi metodi, è possibile confrontare i livelli allo stato stazionario di DPC o dopo l'esposizione a un agente di DPC-produzione in differenti ambiti di provenienza genetici. Le due strategie che sono state più ampiamente usate coinvolgono separa DPC-contenenti DNA DNA libero utilizzando una strategia di associazione di membrana di nitrocellulosa o KCl/SDS precipitazioni12,13. Nell'approccio ex cellule sono lisate e passare attraverso un filtro di nitrocellulosa. Perché nitrocellulosa si lega la proteina, il filtro trattiene le proteine-collegato del DNA, permettendo di DNA libero di passare attraverso. Nella strategia di quest'ultima legato alle proteine DNA è separato dal DNA libero basato sul fatto che SDS si lega alla proteina ma non del DNA e può essere precipitato con l'aggiunta di KCl. Di conseguenza, legati a proteine DNA diventa insolubile mentre il DNA non legato rimane in soluzione. DPC-contenenti DNA può poi quantificata utilizzando radiomarcata timidina (se le cellule sono stati inizialmente metabolicamente etichettate) o di un colorante fluorescente DNA-selettivo come Hoechst 33258. Questi metodi sono riproducibili e richiedono un piccolo numero di passi. Tuttavia, non forniscono informazioni riguardanti la natura della reticolazione chimica attraverso il quale la proteina è collegata al DNA. Inoltre, è importante notare che queste analisi possono sovrastimare DPC riparare falsamente segnando riparazione incompleta, cioè, proteolitici elaborazione a più piccoli collegamenti incrociati di DNA-peptide che possono non essere così facilmente intrappolati o precipitato, come DNA buona fede riparazione.
Saggi di cometa possono essere utilizzati per visualizzare la formazione DPC in cellule14. In questi esperimenti, la presenza di DPC ridurre la migrazione del DNA che possa poi essere invertiti pretrattando con proteinasi K. Di conseguenza, la lunghezza della coda consente di stimare la formazione DPC. Tuttavia, come accennato in precedenza, farmaci DPC-formando creano altri tipi di danno al DNA che potrebbe alterare la lunghezza della coda. Questo protocollo è anche altamente tecnico e richiede competenze e formazione in imaging confocale.
Spettrometria di massa può essere utilizzata per studiare la cinetica di riparazione DPC dopo il trattamento con agenti di reticolazione15,16,17. Questi esperimenti trattano le cellule con DPC-formare agenti e isolare le DPC tramite estrazione di biotina cattura o fenolo: cloroformio (1:1). Spettrometria di massa può quindi essere utilizzata per identificare le proteine di reticolato o quantificare la quantità di DPC formate nel tempo. Il principale vantaggio di questo approccio è la natura dei dati prodotti. È possibile al proprio catalogo i tipi di proteine che diventano reticolato a seguito dell'esposizione ad un xenobiotici, tuttavia, il presente protocollo è costoso, richiede tempo ed è limitata dal tipo di reticolazione che può essere rilevato.
Maizels et al ha sviluppato un 'RADAR' sensibili (avvicinamento rapido al DNA del complesso recupero) test per quantificare immunodetection di DNA-proteina addotti come pure un RADAR basati su ELISA test18,19. Queste analisi sono utili soprattutto per intrappolare intermedi della DNA-proteina che transitoriamente formano nelle cellule e generano campioni adatti per spettroscopia di massa identificare nuove proteine addotti. Questo saggio immunodetection dipende dalla disponibilità degli anticorpi per catturare la reticolazione della DNA-proteina e, pertanto, potrebbe non essere in grado di rilevare il DNA degradato-peptide addotti che si formano durante la riparazione. Recentemente, un DPC specifico riparazione via legata alla replicazione del DNA e un DNA-dipendente metalloprotease Spartan è stato scoperto nel quale le DPC sono proteolyzed a peptidi più piccoli durante la riparazione20,21. Ereditato mutazioni in questo gene sono associate con la sindrome di Ruijs-albanese in esseri umani, una malattia caratterizzata da instabilità genomica, invecchiamento precoce e cancro del fegato22. Topi con difetti del gene Spartan geneticamente visualizzano simili fenotipi23.
Riattivazione della cellula ospite di attività trascrizionale è stata utilizzata per studiare la riparazione di lesioni definite presenti sul plasmide transfected DNA substrati24,25. In questi esperimenti, plasmide contenente DPC (o altri tipi di lesioni del DNA) che bloccano la trascrizione di un reporter, come la luciferasi, transfected nelle cellule. Misure a luminescenza preso 24-72 h, più tardi, quindi sono correlati con DPC di riparazione. Tuttavia, queste analisi indiretta riparazione non sono in grado di rilevare eventi di ripristino precedenti post-transfezione 24h e non possono distinguere tra RNA polimerasi esclusione di substrati parzialmente riparati e la riparazione completa.
Ciascuno dei metodi descritti in precedenza ha vantaggi e ha contribuito al modello attuale di riparazione DPC. Tuttavia, il dosaggio di SSPE-qPCR elude molti dei limiti connessi con questi altri approcci e pertanto in grado di garantire più specifica comprensione nei meccanismi di riparazione DPC. Ad esempio, il dosaggio di SSPE-qPCR può direttamente misurare riparazione di site-specific DPC sul DNA in cellule di mammifero intatte. Questo metodo è versatile ed è stato utilizzato per ottenere risultati di riparazione dopo trasfezione in criceto e linee cellulari umane. Transfezione del plasmide può essere eseguita mediante lipofezione o elettroporazione in linee cellulari di mammifero coltivate. Assicura inoltre che solo riparazioni di DPC definita viene misurato, e non altri tipi di danno del DNA indotto da agenti DPC-formando la maggior parte. SSPE-qPCR è rapido, economico e facile da eseguire. Risultati ottenuti con questa analisi hanno rilevato più presto post-transfezione 2h eventi di ripristino. Utilizzando questo metodo, le variabili che possono influenzare i risultati di riparazione DPC possono essere studiate in maniera sensibile e efficiente. Ad esempio, il ruolo della trascrizione in riparazione DPC deve ancora essere rigorosamente valutati. Grazie alla flessibilità del dosaggio SSPE-qPCR, il sito di reticolazione del DPC può essere manipolato per rispondere a questo interrogativo. Inoltre, l'introduzione di un'origine di replicazione nel plasmide DPC-cuscinetto utilizzabile per affrontare l'influenza della replica sulla riparazione DPC. Inoltre, più legami incrociati possono essere creati sul plasmide per esaminare le differenze nella riparazione di un singolo DPC contro molteplici legami incrociati. Queste sono domande che sarebbero difficile rispondere usando il DNA cromosomico ma possono facilmente essere risolto usando l'analisi di SSPE-qPCR. Nel complesso, il dosaggio di SSPE-qPCR richiede purificato, il DNA del plasmide nelle quantità di microgrammo contenente una lesione di un percorso noto. Addotti oltre DPC può essere usato per questo test, tuttavia, la lesione deve essere in grado di bloccare l'estensione di Taq polimerasi.
Protocol
1. generazione del plasmide contenente DPC
- Combinare 80 pmol dell'oligonucleotide contenente un residuo di 8-oxoguanine (20 µ l) con 10 unità della chinasi di polinucleotide T4 (1 µ l) nel buffer di 10 x ligasi (5 µ l). Aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 50 µ l e incubare a 37 ° C per 30 min in un bagno di acqua riscaldata.
- Combinare il oligonucleotide fosforilato (50 µ l), 80 pmol di DNA single-stranded (80 μL), 100 unità Taq polimerasi (20 µ l) in 10 x Taq tampone di reazione (25 µ l), 100 mM ATP (20 µ l), 10 mM dNTPs (20 µ l), NEB buffer 2 (25 µ l) e 8 µ g BSA (20 µ l) per il totale 260 µ l. Incubare la campione in un termociclatore a 75 ° C per 15 min seguita da 37 ° C per 5 min. Successivamente, aggiungere 60 U di T4 polimerasi (20 µ l), 8.000 U T4 ligasi (20 µ l), 100 mM ATP (20 µ l), 10 mM dNTPs (20 µ l), NEB buffer 2 (15 µ l) e 8 µ g BSA (20 µ l) per un totale di 375 µ l. incubi la reazione durante la notte a 37 ° C (Figura 1A).
- Creare una miscela di 50: 50 buffer-saturi fenolo: cloroformio. Aggiungere volumi uguali di ogni componente, mix e spin in una centrifuga di tavolo a 21.130 x g per 5 min, cloroformio unità acqua fuori il fenolo saturato di buffer per formare due strati: uno strato acquoso superiore e un'inferiore, strato organico. µ L 375 del livello inferiore, organico per la reazione di estensione di primer, mix e spin in una centrifuga di tavolo a 21.130 x g per 5 min.
Attenzione: Fenolo e cloroformio sono sostanze pericolose e precauzioni devono essere prese per evitare il contatto con gli occhi o la pelle.- Dopo centrifugazione, con attenzione estrarre lo strato superiore e mescolare con acetato di ammonio aggiunto a una concentrazione finale di 0.3 M seguita da 2 volumi di etanolo al 100%. Conservare la soluzione a-20 ° C per un minimo di 30 min o durante la notte.
- Spin il campione in una centrifuga di tavolo a 15.000 giri/min x a 4 ° C per 10 minuti rimuovere il surnatante e lavare il pellet in 1 mL di etanolo al 70%. Girare il campione in una centrifuga di tavolo a 15.000 giri/min x a 4 ° C per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 100 µ l di acqua.
- 50 µ l di DNA dal passaggio precedente con 16 µ l 6 x tintura gel-caricamento e 34 µ l acqua si combinano e soggette a elettroforesi su un'agarosi di basso-fusione di 0,8% gel contenente 0,5 µ g/mL di bromuro di etidio. Esegua il gel a 2 V/cm su un gel di 10 cm per 6 h in 1 tampone di x TAE. Asportare la band supercoiled utilizzando una lama di rasoio e pesare la fetta di gel (Figura 1A). Eseguire un controllo positivo per servire come indicatore per cui il DNA covalentemente chiuso, supercoiled migra.
Attenzione: Il bromuro di etidio è un agente mutageno e precauzioni devono essere prese per evitare il contatto con la pelle. Inoltre, è importante per ridurre al minimo il tempo che il campione di plasmide è esposto ai raggi UV, al fine di ridurre la formazione di photoproducts UV.- Digerire la fetta di gel aggiungendo il tampone di reazione β-il agarase 10% per ogni mg di peso del gel. Incubare a 65 ° C per 10 minuti e raffreddare a 42 ° C. Aggiungere 10 U di β-il agarase e incubare a 42 ° C per 1 h.
- Incubazione seguente, misurare il volume e aggiungere l'acetato di ammonio a una concentrazione finale di 0.3 M e chill sul ghiaccio per 15 min. centrifuga a 15.000 x g per 15 min a temperatura ambiente, raccogliere il surnatante e aggiungere 2 volumi di isopropanolo. Freddo a-20 ° C durante la notte.
- Centrifugare il DNA supercoiled, purificato per 10 min a 15.000 giri/min x in una centrifuga di tavolo a 4 ° C e risospendere il pellet in 40 µ l di acqua.
- Crosslink 12 pmol (15 µ l) di DNA a 36 pmol di oxoguanine glicosilasi (1 µ l) in tampone contenente NaCl 100 mM (3 µ l), 1 mM MgCl2 (3 µ l), 20 mM Tris-HCl pH 7.0 (6 µ l) e 10 mM sodio cianoboroidruro (2 µ l) per raggiungere un volume finale di 30 µ l a 37 ° C per 30 min26. Rimuovere 1 µ l di campione di reticolati e diluire in 500 µ l di acqua per servire come un h 0 dati punto e analizzare il PCR nel passaggio 3.
2. kCl/SDS precipitazioni
- Per visualizzare l'efficienza di reticolazione, restrizione digerire 1 µ g del plasmide reticolato con 1 μL DI Bspnel buffer di x 10 a 37 ° C per 1 h generare due frammenti di DNA di dimensioni diverse.
Nota: Un frammento sarà irradiato alla proteina (4,4 kb) e l'altro non sarà (2,8 kB) (Figura 1B).- Dividere i campioni a metà, aggiungere SDS per entrambi ad una concentrazione finale di 0,5% e incubare a 65 ° C per 10 min.
- Aggiungere KCl (concentrazione finale 100 mM) per uno dei campioni e incubare in ghiaccio per 5 min.
- Centrifugare entrambi i campioni a 12.000 x g per 5 min a 4 ° C ed eseguire i surnatanti su un gel di agarosio per stimare la percentuale coniugazione della proteina al DNA12.
Nota: Precipitazione di KCl/SDS è utilizzato per il controllo di qualità, non la preparazione del substrato.
3. transfezione in cellule di mammifero
- 1 giorno prima della trasfezione, piastra di 0,5 x 106 cellule/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Il giorno successivo, mescolare 1,5 µ g (30 µ l) del plasmide contenente DPC (dal punto 1.6) con 300 µ l di terreno di coltura privo di siero. In un altro tubo, mescolare 12 µ l di reagente di transfezione e 300 µ l di terreno di coltura privo di siero. Combinare 300 µ l di DNA diluito con 300 µ l di reagente di transfezione diluito e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 250 µ l dei complessi in ciascuno dei due pozzetti e incubare per un minimo di 1 h a 37 ° C.
- A seguito di incubazione, rimuovere i supporti, aggiungere 1 mL di 0,6% SDS/0,01 M EDTA e incubare a temperatura ambiente per 10-15 min raschiare le celle utilizzando un poliziotto di gomma e trasferire in una provetta di microfuge 1,5 mL. Aggiungere 200 µ l di invertire di (concentrazione finale di 1 M), 5 M di NaCl delicatamente 5 volte e incubare a 4 ° C durante la notte del27.
- Centrifugare i campioni a 21.130 x g in una centrifuga di tavolo a 4 ° C per 30 min, raccogliere il surnatante, precipitato di etanolo come descritto sopra e risospendere in 50 µ l di acqua.
4. SSPE-qPCR
- Mescolare 1 µ l di DNA recuperato da ogni punto di tempo (compreso 0 h), 2 x mix master SYBR green PCR (30 µ l), 27 µ l di acqua e 1 µ l (100 pMol) di primer complementari al filamento danni del plasmide (Primer R, Figura 2). Eseguire PCR utilizzando le seguenti condizioni: iniziale pre-fusione per 10 min a 90 ° C, seguita da 8 cicli di: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Al completamento del ciclo di 8 aggiungere 1 µ l (100 pMol) dell'iniettore secondo per totale 60 µ l (L di Primer, Figura 2)28 (Vedi Tabella materiali particolari reagenti).
- Mescolare 1 µ l di amplificato recuperato il DNA da ogni punto di tempo (compreso 0 h), 2 x mix master (30 µ l), 27 µ l di acqua e 1 µ l di ciascun primer (100 pMol) per totale 60 µ l.
- Caricare una piastra PCR a 96 pozzetti con i campioni da punti 4.1 e 4.2 (20 µ l/pozzetto, in triplice copia) ed eseguire qPCR per 30 cicli utilizzando le condizioni sopra descritte.
- Media dei valori di CT da ciascuna serie di campioni triplici. Sottrarre i valori di CT generati nel passaggio 4.1 da quelli in fase 4.2 per ottenere il valore di CT per ogni campione di delta. Sottrarre il punto di tempo 0 h dal valore delta CT per rimuovere qualsiasi sfondo (Vedi Rappresentante risultati sezione per una descrizione dettagliata).
- Convertire il valore CT di delta in percentuale riparazione utilizzando la formula:
Representative Results
Al fine di utilizzare il test di SSPE-qPCR per valutare la riparazione cellulare DPC, una quantità sufficiente (importi µ g) di substrato di alta qualità DPC riparazione deve essere preparata. Per ottenere questo prodotto, un oligonucleotide contenente un residuo di 8-oxoguanine è stato ricotto per complementare DNA single-stranded, primer esteso e gel purificato per garantire che solo covalentemente, prodotto circolare chiuso è stato utilizzato per transfezioni (Figura 1a). la relazione si concentra su substrati in cui boroidruro-trapping viene utilizzato per creare una reticolazione covalente tra oxoguanine umano ricombinante glicosilasi e un'unità di ribosio su una molecola a doppia elica plasmide circolare, anche se analoga approcci può essere utilizzato per ottenere chimicamente diversi DPC substrati. La strategia di intrappolamento glicosilasi/boroidruro di oxoguanine è particolarmente attraente data l'efficienza estremamente elevata della reazione di reticolazione. Come mostrato in Figura 1B, precipitazione di KCl/SDS eseguita su un substrato DPC che era stato digerito in due frammenti in modo selettivo e quasi quantitativamente impoverito il frammento di DNA che harboring il DPC. Questi risultati sostengono la conclusione che essenzialmente il 100% delle molecole substrato plasmide contiene una proteina crosslink.
Il test di SSPE-qPCR descritto nella sezione protocollo utilizza valori CT generati da qPCR per calcolare la percentuale di riparazione DPC dopo trasfezione in cellule di mammifero. Come illustrato dalla Figura 2 , la reticolazione della proteina blocca Taq polimerasi estende il primer 'R' appaiato al filamento DPC-contenente. Una caratteristica critica, seconda di questo test è l'incorporazione di otto turni delle reazioni di SSPE (utilizzando il primer R) prima dell'esecuzione del saggio di qPCR. Mentre il DNA intatto (o riparato) sarà esteso durante queste reazioni di SSPE, creazione di un sito di legame per il primer 'L' a valle, DNA danneggiato (o DNA riparato in modo incompleto) non viene estesa. Di conseguenza, SSPE aumenta l'abbondanza di ogni filamento intatto (o riparato) da otto. Ciò significa che riparato campioni in cui il passaggio SSPE è stato eseguito prima del qPCR visualizzerà un valore di CT che è tre unità inferiore a quella ottenuta per un campione identico in cui SSPE non è stata eseguita prima del qPCR (Figura 2). La differenza di tre unità in CT valori osservati per i due trattamenti, indicati come ΔCT, riflette il fatto che 8 = 23. Questo delta valore CT può essere utilizzato per calcolare l'attività di riparazione del DNA cellulare utilizzando la formula: riparazione del DNA percentuale = (2ΔCT /23) x 100. Esperimenti di controllo hanno confermato che un delta valore CT di circa 3 costantemente è stato osservato quando plasmidi substrato intatto sono stati sottoposti alla SSPE-qPCR (dati non mostrati).
Tabella 1 illustra valori di esempio CT che sono stati generati da DPC-contenenti substrati di plasmide che sono stati recuperati da fibroblasti di polmone di criceto cinese 3 h e post-transfezione 8h (tabella 1A), così come da tempo zero campioni, cioè, campioni che sono stati preparati come descritto nella sezione protocollo, ma non transfected nelle cellule (tabella1B). La tabella fornisce anche la ΔCT, e valori di riparazione per cento (calcolato utilizzando la formula 2ΔCT23 x 100) ottenuti da questi campioni. Come illustrato nella tabella 1A, la riparazione delle percentuali calcolata da campioni raccolti 3h e post-transfezione 8h era 66% e 93%, rispettivamente. Questi valori sono quindi sottratto da quello ottenuti dall'analisi del campione 0 h per determinare la percentuale di riparazione. Tabella 1B raffigura i valori CT per due campioni differenti h 0 in cui reticolazione efficiente è stato o non è stato raggiunto prima della transfezione. In modo efficiente reticolato campione ha provocato un delta valore CT di 0,8 mentre un campione di reticolati mal ha provocato un delta valore CT di 2.5. Ad oggi, non è stato possibile determinare con precisione la fonte del segnale sfondo 0,8 nell'efficientemente reticolato di campione 0 h. È improbabile che questo sfondo riflette un livello basso di entrambi rimozione DPC spontanea, o è a causa di un basso livello di Taq polimerasi 'bypass' sintesi attraverso la lesione DPC: sperimentazione estesa eseguita su substrato di M13 singolo filamento altamente purificato coerentemente ha reso un delta valore CT di circa 0,8, cioè, essenzialmente identico a questo 'sfondo' estensione del visto in substrati contenenti DPC. Di conseguenza, è probabile che ci sia un piccolo grado di mis-adescamento del primer 'R' durante SSPE che provoca la generazione di una piccola quantità di prodotto che può successivamente essere amplificata quando il primer 'L' viene aggiunto e qPCR eseguite. Gli sforzi per eliminare questo sfondo manipolando condizioni di PCR hanno, ad oggi, non è riuscito a porre rimedio a questo difetto. Tuttavia, la strategia di sottrazione descritta sopra consente una stima accurata delle attività di riparazione DPC. Vale la pena notare che inefficiente reticolazione della proteina sul plasmide si tradurrà in un valore elevato background. Questo è illustrato nei dati di esempio forniti nella tabella 1B dove reticolazione inefficiente proteina-DNA provocato un delta di più alto valore di CT per tempo 0. Di conseguenza, gli esperimenti di controllo sono invariabilmente eseguiti prima di iniziare transfezioni e substrati con valori di CT delta elevati sopra la 0.8 livello soglia vengono scartati. Come accennato nel protocollo qPCR, ogni campione è suddiviso in 3 pozzi per garantire la coerenza di pipettaggio. Queste repliche sono fatte la media poi per ottenere il valore di CT per quel campione. Replica che deviano più di ± 0,1 sono state eliminate dal set di dati. Se tutte le tre repliche si discostano più di ± 0.1 da altro, il dosaggio di SSPE-qPCR è rifatto fino a quando si ottengono valori coerenti. L'esperienza dimostra che almeno 3 transfezioni indipendente devono essere eseguite per ottenere valori medi affidabili che poi possono essere sottoposti ad analisi statistica per determinare l'influenza dei vari parametri sull'efficienza di riparazione DPC.
Figura 1. Generazione di un plasmide contenente DPC. (A), un oligonucleotide contenente un residuo di 8-oxo-guanina (rosso) è temprato a DNA single-stranded (cerchio nero grassetto) ed estesa per creare double-stranded plasmide (prodotto di estensione primer indicato dalla linea tratteggiata). Dopo l'elettroforesi in bromuro di etidio, alla fascia corrispondente al DNA supercoiled (scatola rossa) è asportata da un gel dell'agarosi di basso-fondere e digerita con β-il agarase. Corsie: (1) peso molecolare marcatore, DNA a filamento singolo (2), (3) double-stranded DNA, (4) primer esteso campione. (B) Oxoguanine glicosilasi (abbreviato hOGG1, raffigurato come un cerchio arancione) sono irradiato al residuo 8-oxo-guanina tramite sodio cianoboroidruro e il risultante DPC substrato digerito per generare una coppia di basi 2.800, frammento di DNA libero e un 4.400 frammento di base-accoppiamenti associata alla proteina. SDS è aggiunto al campione che è poi diviso in due parti, uno dei quali è trattato con KCl e centrifugato per sedimento DPC-contenenti DNA (raffigurato come una pallina arancia). Il surnatante da questo esempio quest'ultimo (raffigurata come blu liquido nella provetta da centrifuga) e l'esempio non esposto al KCl sono sottoposti a elettroforesi del gel. Corsie: marcatore (1) peso molecolare, (2) -KCl, (3) + KCl. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: quantificazione del plasmide danneggiato tramite SSPE-qPCR. Il DNA del plasmide è denaturato e un primer complementare al filamento danneggiato (R) è temprato ed estesa. Questo processo viene ripetuto per un totale di 8 cicli. Con un substrato danneggiato (in alto), Taq polimerasi è bloccata dalla lesione DPC e non produrrà integrale prodotto fili. Al contrario, con un substrato riparato (in basso), Taq polimerasi produrrà fili full-length prodotto contenente il sito di legame per primer L. Dopo 8 cicli, primer L viene aggiunto e valori di soglia del ciclo sono determinati utilizzando qPCR. Risultati di amplificazione di esempio per substrati danneggiati e non danneggiati sono illustrate sulla destra con la linea rossa che rappresenta il DNA che ha subito di estensione dell'iniettore prima qPCR e blu che rappresentano il DNA che non era primer esteso prima del qPCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tabella 1A | ||||
| Tempo | -Primer extension | + Estensione primer | Δ CT | Riparazione delle percentuali |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| 3 h | 23,5 | 21,1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29,4 | 26,5 | 2.9 | 93 |
| Tabella 1B | ||||
| Tempo | -Primer extension | + Estensione primer | Δ CT | Priorità bassa percentuale |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| h 0 | 15.4 | 14,6 | 0,8 | 22 |
| h 0 | 15.4 | 12,9 | 2.5 | 71 |
Tabella 1: calcolo per cento di riparazione utilizzando i valori di CT generati da SSPE-qPCR. (A) riparazione di un substrato DPC-contenente trasfettati in fibroblasti di polmone di criceto cinese V79 3 h e post-transfezione 8 h. (B) SSPE-qPCR di h 0 campioni non transfettate nelle cellule. In un campione l'efficienza della reazione di reticolazione tra DNA e oxoguanine glicosilasi era alta (questo campione ha reso un valore basso delta CT) mentre in altri l'esempio l'efficienza della reticolazione della proteina era basso (questo campione ha reso un delta relativamente elevato Valore di CT). Vedi testo Rappresentante risultati per dettagli.
Discussion
Il metodo di SSPE-qPCR offre numerosi vantaggi rispetto ad altri approcci esaminando la riparazione di una popolazione omogenea contenente una singola lesione definita DPC. È interessante nota che oltre a controllare l'identità della proteina e del tipo di reticolazione chimica utilizzata per collegare la proteina al DNA, è possibile modificare facilmente il contesto di sequenza in cui la lesione DPC è stato introdotto. Abbiamo esplorato l'influenza sulla riparazione DPC di introdurre la lesione sia il modello o codifica strand di un plasmide a valle di un locus promotor attiva. Allo stesso modo, stiamo studiando l'influenza sulla riparazione DPC di replica utilizzando un plasmide di M13 contenente un'origine di SV40 di replicazione transfettate nelle cellule HEK293T. Il test qui descritti direttamente riparazione DPC misure, al contrario di altre strategie, come riattivazione di cellula ospite che indirettamente stime ripristino attività24,25. Inoltre, il sistema è robusto, sensibile e quantitativa. A differenza di altri sistemi, che misurano rimozione DPC, questo test rileva solo eventi di ripristino completo, cioè, richiede non solo che la lesione DPC essere rimossa, ma che l'integrità del DNA duplex essere completamente restaurato17. Questo è perché abasic siti e scalfitture o interruzioni nella spina dorsale fosfodiesterico bloccano efficacemente come l'originale di lesione DPC29il dosaggio.
Mentre questo rapporto si concentra su un particolare tipo di DPC, che è stato creato da intrappolamento boroidruro di reazione enzima intermedio, attualmente stiamo sviluppando approcci per studiare la riparazione del DPC che coinvolgono altre proteine e lesioni in cui il legame della proteina con il DNA si verifica attraverso la base di analoghi nucleosidici, piuttosto che la posizione di ribosio. Utilizzando amminazione riduttiva, abbiamo creato legami incrociati della proteina e del peptide collegato alla guanina o citosina base di un DNA primer30. Questi oligonucleotidi sono state purificate ad omogeneità e utilizzati per generare supercoiled plasmidi contenenti legami incrociati della DNA-proteina e DNA-peptide. Mentre l'efficienza di queste reazioni è alquanto ridotta rispetto a quello dell'oxoguanine glicosilasi crosslink approccio descritto dettagliatamente sopra, erano tuttavia successo e consentire l'esame di riparazione di questi substrati nel selvaggio-tipo e linee di cellule di mammifero di riparazione-carenti l'asportazione del nucleotide. Abbiamo inoltre abbiamo usato l'analisi di SSPE-qPCR per studiare la riparazione delle lesioni oxoguanine e un coniugato sintetico ribosio-colesterolo, che precedentemente è stato indicato per essere riparato tramite il cellulare del nucleotide asportazione riparazione macchine31. Come Figura 2 descrive graficamente, riparazione di qualsiasi lesione che estensione dell'iniettore blocchi di Taq polimerasi può, in linea di principio, essere misurato usando l'analisi di SSPE-qPCR.
I modelli attuali di riparazione DPC suggeriscono che più grandi DPC (> 10 kDa) sono sottoposti a elaborazione proteolitica di più piccola lesione del peptide prima della rimozione32,33,34. Sono candidati più probabili responsabili per questa proteolisi proteasoma o una proteasi specifica in cellule umane denominato Spartan20,21,35,36,37, 38. ulteriori chiarimenti nei ruoli di queste proteasi possono essere condotte usando l'analisi di SSPE-qPCR. Inibitori del proteasoma potrebbero essere utilizzati per pretrattare le cellule prima di transfezione con substrati contenenti DPC. In alternativa, linee cellulari di atterramento Spartan potrebbero trasfettate con plasmidi danneggiati per delucidare il suo ruolo nella proteolisi di DPC più grandi.
Indipendentemente dal metodo utilizzato per creare il crosslink o della natura della lesione del DNA, vale la pena sottolineare che la metodologia di SSPE-qPCR dipende criticamente la capacità di generare notevoli quantità di substrato DPC-plasmide omogeneo. Passi essenziali per questa analisi comprendono purificazione del legame covalente, plasmide circolare chiuso seguito di estensione dell'iniettore per eliminare qualsiasi scalfito o molecole lineari plasmide. Questi contaminanti devono essere eliminati per garantire che qualsiasi riparazione successiva DPC osservato non è a causa di processi di riparazione pausa-diretto diretto da nick o doppio filamento. Mancato ottenimento di una quantità sufficiente di DNA supercoiled seguendo le reazioni primer estensione può essere superato variando il rapporto di oligonucleotidi a DNA single-stranded. Un altro passo importante per il metodo di SSPE-qPCR, è l'efficienza di reticolazione della proteina per il plasmide. In questo studio, è stata utilizzata una reazione enzimatica, efficiente a reticolare la proteina glicosilasi oxoguanine ad una lesione 8-oxo-guanina. Sub-ottimale reticolazione può essere migliorato variando la quantità di proteina aggiunta alla reazione.
Mentre i risultati descritti in questo rapporto è invocata da lipofezione per introdurre DPC riparazione substrati nelle cellule destinatario, non c'è ragione, a priori, non potrebbero essere utilizzati altri metodi transfezioni. Abbiamo svolto gli studi preliminari e osservato che di elettroporazione39 può anche essere usato. Tuttavia, vale la pena notare che nella nostra esperienza, l'efficienza di trasfezione di elettroporazione è ridotto rispetto al lipofezione, e ci è sembrato necessario utilizzare DNA vettore (fino a 5 µ g) oltre l'1,5 µ g di DPC substrato per ottenere dati di riparazione. Nel complesso, il metodo di SSPE-qPCR sopra descritto fornisce un modo innovativo per esclusivamente esaminare riparazione DPC il DNA plasmidico e generare nuovo approfondimento la risposta al danno al DNA.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner è supportato da Training Grant 5T32HL007741. Grazie Natalia Tretyakova (Università del Minnesota) e Ashis Basu (Università del Connecticut) ed i loro membri di laboratorio di supporto e consulenza tecnica durante la prima e stadi intermedi di questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
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