Summary

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Published: April 10, 2018
doi:

Summary

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

Abstract

Aneuploïdie embryonnaire est la principale cause génétique de la stérilité chez l’homme. La plupart de ces événements sont créés au cours de la méiose femelle, et quoique corrélés avec l’âge maternel, âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Donc, les variantes génétiques pourraient expliquer pour la ségrégation des chromosomes incorrect au cours de l’ovogenèse. Étant donné que l’accès à des ovocytes humains est limitée à des fins de recherche, une série de tests ont été développés pour étudier la fonction du gène humain au cours de la méiose I à l’aide des ovocytes de souris. Tout d’abord, l’ARN messager (ARNm) du gène et variant du gène d’intérêt sont microinjected dans des ovocytes de souris que j’ai arrêté la prophase. Après avoir laissé le temps à l’expression, ovocytes sortent de façon synchrone en maturation méiotique pour compléter la méiose I. Par le marquage de l’ARNm avec une séquence d’un reporter fluorescent, tels que de la protéine fluorescente verte (Gfp), la localisation de la protéine humaine peut être évaluée en plus les altérations phénotypiques. Par exemple, gain ou perte de fonction peut être étudiée par l’établissement de conditions expérimentales qui remettent en question le produit du gène pour corriger les erreurs méiotiques. Bien que ce système est avantageux dans les enquêtes sur la fonction de protéine humaine durant l’ovogenèse, l’interprétation adéquate des résultats devrait être entreprise, étant donné que l’expression de la protéine n’est pas aux niveaux endogènes et, à moins que contrôlé (c’est-à-dire frappé out ou vers le bas), murins homologues sont également présents dans le système.

Introduction

L’infertilité est une maladie qui touche 10 à 15 % de la population humaine d’âge procréateur 1, d’où presque moitié cherche un traitement médical 2. Bien que l’étiologie de l’infertilité est diversifiée et une anomalie génétique la plus courante chez l’homme est souvent multifactorielle, aneuploïdie embryonnaire 3. Aneuploïdie est définie comme l’écart (gain ou perte) du bon nombre de chromosomes dans une cellule. Le phénomène de l’aneuploïdie sur les embryons humains est fréquent et augmente avec l’âge maternel avancé 4,5. Quatre essais comparatifs randomisés ont mis en évidence l’avantage de la sélection des embryons (euploïdes) seulement chromosomique normales pour le transfert de l’utérus parce que cette stratégie a donné lieu à des taux accrus d’implantation, taux d’avortement spontané et un temps plus court pour atteindre la grossesse 6,7,8,9. Par conséquent, comprendre l’étiologie de l’aneuploïdie humaine peut avoir des implications importantes en procréation assistée.

Bien que le dépistage génétique pré-implantatoire pour aneuploïdies est bénéfique dans les traitements contre l’infertilité, une compréhension approfondie de la façon dont sont originaires les aneuploïdies fait encore défaut. Il est largement admis qu’il existe une corrélation positive des aneuploïdies méiotiques (son originaires au cours de la production des gamètes) et âge de la mère, cependant, certains taux d’aneuploïdie embryonnaires présents des femmes qui s’écartent de la moyenne pour leur âge donné 4. Ces cas donnent à penser que l’âge seul n’est pas toujours prédictive du risque de générer un embryon aneuploïde. Autres facteurs peuvent jouer un rôle dans l’augmentation du risque d’aneuploïdie embryonnaire, comme les variantes génétiques.

Un aspect clé de l’enquête sur la contribution potentielle d’un variant du gène de l’aneuploïdie au cours de la méiose de l’ovocyte est de concevoir un système pour évaluer rapidement la fonction du gène méiotique. En raison des contraintes éthiques et un accès limité, il est impossible de réaliser ces expériences à l’aide d’ovules humains. Ces problèmes peuvent être contournés en utilisant des ovocytes de souris, et ici une série de tests pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I sont décrites. Par microinjecting l’ARN messager (ARNm) codant pour la variante du gène d’intérêt, la localisation de la protéine humaine dans le œuf de souris peut être visualisée et utilisée pour déterminer si l’expression ectopique de la protéine humaine sauvage et mutante dans un altérations phénotypiques qui pourraient conduire à une aneuploïdie. Ces phénotypes comprennent une augmentation dans les microtubules qui s’attachent à la mauvaise sœur kinétochore et l’incapacité de soutenir l’alignement des chromosomes en métaphase de la méiose I. ce qui est important, ce protocole peut être utilisé pour étudier le gain et perte de fonction variants génétiques en établissant des conditions expérimentales spécifiques à contester les événements clés de la méiose de l’ovocyte tels que broche d’alignement bâtiment et le chromosome 10.

Protocol

1. molecular Cloning Obtenir le DVD complet séquence codante du gène d’intérêt et le plasmide dans vitro transcription (pIVT) vecteur11.NOTE : Clones d’ADNc pleine longueur sont disponibles dans le commerce de différents fournisseurs ou peuvent être générés via la chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR). Le Centre National de ressources en ligne Biotechnology Information (NCBI) fournit des séquences de la transcription des gènes de nucléotide …

Representative Results

Après in vitro transcription haute qualité RNA aura un ratio A260/A280 (1,8 à 2,2) et un ≥1.7 de ratio A260/A230 lorsqu’elle est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. L’image dans la Figure 1 montre la migration de in vitro-produit RNA sur un gel d’agarose dénaturation après électrophorèse. Un groupe qui est étalé dans le modèle ou un échantillon qui a plusieurs bandes de tailles peut indiquer la contamination ou…

Discussion

En raison de l’identification rapide et croissante des humains variantes génétiques associées à la maladie, il est essentiel que les systèmes sont établies afin d’évaluer leur importance biologique. Comprendre la fonction des protéines dans la méiose humain pose des défis particuliers car les ovocytes humains sont précieux et sperme rare et humaine ne se prêtent pas aux manipulations génétiques. Les ovocytes de souris sont un système modèle mammifère précieux pour l’évaluation humaine gène méio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche de l’American Society for Reproductive Medicine et du Charles et Johanna Busch Memorial Fund à l’Université Rutgers, The State University de NJ à K.S. est a été financée par une subvention de la N.I.H. (F31 HD0989597).

Materials

0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

References

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Cite This Article
Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

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