Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben
Summary
İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.
Abstract
Embriyonik anöploidi infertilite insanlarda önemli genetik nedenidir. Bu olayların çoğu kadın mayoz sırasında kaynaklanan ve olumlu maternal yaşla ilişkili olsa yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil. Bu nedenle, gen türevleri yanlış kromozom ayrımı oogenesis sırasında hesap. Verilen bu insan yumurta erişimi sınırlı araştırma amaçlı, deneyleri dizi insan gen işlevi mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak eğitim için geliştirilmiştir. İlk olarak, mesajcı RNA (mRNA), gene ve gene değişken faiz profaz-tutuklandı fare yumurta microinjected. İfade için zaman tanıyacaktır sonra yumurtalar zaman uyumlu olarak yayımlanan mayoz tamamlamak için segregasyonun olgunlaşma ben. MRNA floresan bir muhabir, yeşil flüoresan protein (Gfp) gibi bir dizi ile etiketleyerek insan proteini lokalizasyonu fenotipik değişiklikler ek olarak değerlendirilebilir. Örneğin, kazanç veya fonksiyon kaybı segregasyonun hataları düzeltmek için gen ürünü meydan deneysel koşullar kurarak soruşturma olmaktır. Bu sistem oogenesis sırasında insan proteini işlevi soruşturma avantajlı olsa da, yeterli yorumu sonuçları göz önüne alındığında bu protein ifade endojen düzeylerde değildir ve (çaldıYani için kontrol sürece yapılmalıdır dışarı veya aşağı), fare homologs da sistemde.
Introduction
Kısırlık üreme çağındaki 1hangi neredeyse tıbbi tedavi 2yarım saniyeden aramak, insan nüfusunun % 10-15 etkileyen bir durumdur. İnfertilite etiyolojisi farklı olmasına rağmen ve birçok durumda multifaktöriyel insanlarda en sık görülen genetik anormallik embriyonik anöploidi 3‘ tür. Anöploidi kromozom hücrede doğru sayıda sapması (kazancı veya kaybı) olarak tanımlanır. İnsan embriyosu anöploidi olgusu yaygındır ve ileri maternal yaş 4,5ile artar. Dört randomize kontrollü çalışmaların artan implantasyon oranları, düşük oranları daha düşük ve daha kısa bir süre için bu strateji sonuçlandı çünkü tek kromozom normal (euploid) embriyolar rahim transfer için seçme yararı sermiştir gebelik 6,7,8,9ulaşmak. Bu nedenle, insan anöploidi etyolojisinde anlama önemli etkileri yardımcı üreme olabilir.
Aneuploidies için ön-implantasyon genetik test kısırlık tedavi sonuçlarının karşılaştırılması yararlı olmakla birlikte, nasıl aneuploidies kaynaklanan kapsamlı bir anlayış hala eksik. Bu yaygın segregasyonun aneuploidies (gamet üretim sırasında kökenli) ve maternal yaş, ancak, onların belirli yaş 4için ortalama oranı sapma bazı kadınlar mevcut embriyonik anöploidi oranları pozitif bir korelasyon olduğu kabul edilir. Bu gibi durumlarda yaş tek başına her zaman aneuploid bir embriyo oluşturma riski akıllı değil öneririz. Diğer faktörler gen türevleri gibi embriyonik anöploidi riski artan bir rol oynayabilir.
Bir gen varyantı anöploidi potansiyel katkısını oosit mayoz sırasında araştıran bir anahtar hızla segregasyonun gen işlevini değerlendirmek için bir sistem tasarımı için yönüdür. Etik kısıtlamaları ve sınırlı erişim nedeniyle, insan yumurta kullanılarak bu deneyler yapmak zordur. Bu sorunları fare yumurta kullanarak atlatılabilmişlerdir, ve deneyleri mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için bir dizi ben burada açıklanan. Mesajcı RNA (mRNA) faiz gen türevi için kodlama microinjecting tarafından fare yumurta insan protein lokalizasyonu olabilir görüntülenir ve vahşi-türü ve mutasyona uğramış insan proteini Ektopik ifade herhangi içinde sonuçları belirlemek için kullanılan fenotipik değişiklikler anöploidi için neden olabilir. Bu protokolü kazanç ve fonksiyon kaybı araştırmak için kullanılabilir, bu fenotipleri bir artış için uygun olmayan kız kardeşimin kinetochore ve metafaz, kromozom hizalamasını mayoz ı. önemlisi desteklemek için yetersizlik iliştirdiği mikrotübüller içerir. oosit mayoz önemli olaylar gibi meydan okumak için belirli deneysel koşullar kurarak genetik varyantların bina ve kromozom hizalama 10iğ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hastalığı ile ilişkili insan genetik varyantların hızlı ve artan tanımlaması yüzünden sistemleri biyolojik bunların önemini değerlendirmek için kurulan esastır. İnsan mayoz pozlar özel sorunlar işlevinde protein insan yumurta değerli ve nadir ve insan sperm genetik manipülasyon mükellef değildir çünkü anlama. Fare yumurta insan segregasyonun gen işlev 10,23değerlendirmek için değerli bir memeli modeli sistemi vardır. Bu model nasıl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bir araştırma bursu American Society üreme tıbbı ve Charles ve Rutgers Johanna Busch Memorial Fonu tarafından desteklenen, State Üniversitesi, NJ K.S. A.L.N. için bir hibe N.I.H. (F31 HD0989597) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 mL Seal-Rite PCR tube | USA Scientific | 1602-4300 | |
| 1 kb DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0243 | |
| 6X DNA loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| 9-well glass spot plate | Thomas Scientific | 7812G17 | |
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG | Thermo Scientific | A21050 | 1:200 dilution |
| Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG | Thermo Scientific | A21091 | 1:200 dilution |
| Ampicillin | VWR | AA0356 | |
| Anti-vibration table | Technical Manufacturing Corp | any standard model | |
| Anti-Acetylated Tubulin antibody | Sigma Aldrich | T7451 | 1:100 diution |
| Anti-centromeric (CREST) antibody | Antibodies Incorportated | 15-234 | 1:30 dilution |
| Barrier (Filter) Pipette tips | Thermo Scientific | AM12635 | Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0445-07-6 | |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Capillary tubing | Sutter | B100-75-10 | |
| Center Well organ culture dish | VWR | 25381-141 | |
| CO2 tank | For incubator | ||
| Confocal microscope | Zeiss | any standard model | |
| Centrifuge (With cooling ability) | Thomas Scientific | any standard model | |
| Cover Glass 11 x 22 mm | Thomas Scientific | 6663F10 | |
| Coverslips | Thomas Scientific | 6663-F10 | thickness will vary for particular microscopes |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| DEPC H20 | Life Technologies | AM9922 | |
| Digital Dry Bath | Thermo Scientific | 888700001 | |
| Easy A high fidelity cloning enzyme | Agilent | 600400 | For DNA cloning |
| Enzymes for linearizing pIVT | New England Biolabs | NdeI or KasI can be used | |
| Ethidium Bromide | Thermo Scientific | 155585011 | |
| Fluorescent Microscope | Any Fluorescent microscope may be used | ||
| Formaldehyde (37%) | Thermo Fisher Scientifc | 9311 | |
| Formaldehyde RNA loading dye | Ambion | 8552 | |
| Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Full Length cDNA Clones | Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones | ||
| Gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | any standard model | |
| Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| Globin Forward Primer for pIVT Construct | 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'. Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Globin Reverse Primer for pIVT Construct | 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides | ||
| Holding pipettes | Eppendorf | 930001015 | Vacutip |
| Humidified Chamber | Tupperware can be used | ||
| Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads | GE Life Sciences | 27925901 | |
| Incubator | any standard model with CO2 and water jacketed technology | ||
| Inverted Microscope | Nikon instruments | Any Standard model | |
| Image J (NIH) Software | NIH | Image Analysis software | |
| Lid of 96 well plate | Nalgene Nunc International | 263339 | |
| Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube | USA Scientific | 1405-2600 | |
| MacVector | MacVector | Sequence analysis software | |
| MG132 | Selleckchem | S2619 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-3 | |
| Millenium RNA Markers-Formaldehyde | Ambion | AM7151 | |
| Milrinone | Sigma-Aldrich | M4659 | Resuspend in DMSO at 2.5mM |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5310 | Only used embryo-tested, sterile-filtered |
| Monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | Resuspend in DMSO at 100 mM |
| Mouthpiece | Biodiseno | MP-001-Y | |
| N2 tank | for antivibration table | ||
| Nail Polish; Clear | Any clear nailpolish can be used | ||
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | any standard model | |
| NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer | Life Technologies | AM8676 | |
| NorthernMax 10X Running buffer | Life Technologies | AM8671 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running buffer | Thermo Scnentific | NP0001 | |
| Organ Culture Dish 60x15mm | Life Technologies | 08-772-12 | |
| Paraformaldehyde | Polysciences, Inc. | 577773 | |
| PCR Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4484075 | |
| Petri Dish 139 mm | Thermo Fisher Scientifc | 501V | |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientifc | 121V | |
| Petri Dish 60 mm | Falcon BD | 351007 | |
| Picoinjector | XenoWorks Digital Microinjector | any standard model | |
| Pipette puller | Flaming-Brown Micropipette puller | Model P-1000 | |
| pIVT plasmid | AddGene | 32374 | Empty vector suitable for oocyte expression. |
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Lee BioSolutions | 493-10 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | purification of up to 20 uL of plasmid DNA |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Quikchange II site directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | mutagenesis kit for insertions and deletions |
| Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit | Agilent | 210512 | mutagenesis kit for single site changes |
| Scissors (Fine point) | Fine science tools | 14393 | |
| Scissors (Medium point) | Fine science tools | WP114225 | |
| Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Slide Warmer | any standard model | ||
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| Stereomicroscope | any standard model | ||
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | Thermo Fisher Scientifc | 18265017 | |
| Syringe | BD Bioscienes | 309623 | 1 ml, 27G(1/2) |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit | Life Technologies | AM1340 | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | x-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 274348 | |
| Tweezer (Fine point- Size 5) | Fine science tools | SN.743.12.1 | |
| UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientifc | 10977015 | |
| UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL | Thermo Fisher Scientifc | 15585011 | |
| UVP UV/White lite transilluminator | Fisher Scientific | UV95041501 | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 |
References
- Thoma, M. E., et al. Prevalence of infertility in the United States as estimated by the current duration approach and a traditional constructed approach. Fertil Steril. 99 (5), 1324-1331 (2013).
- Boivin, J., Bunting, L., Collins, J. A., Nygren, K. G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: potential need and demand for infertility medical care. Human Reproduction. 22 (6), 1506-1512 (2007).
- Treff, N. R., Zimmerman, R. S. Advances in Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disease and Aneuploidy. Annu Rev Genomics Hum Genet. , (2017).
- Franasiak, J. M., et al. The nature of aneuploidy with increasing age of the female partner: a review of 15,169 consecutive trophectoderm biopsies evaluated with comprehensive chromosomal screening. Fertil Steril. 101 (3), 656-663 (2014).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Scott, R. T. Blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening and fresh embryo transfer significantly increases in vitro fertilization implantation and delivery rates: a randomized controlled trial. Fertil Steril. 100 (3), 697-703 (2013).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertil Steril. 100 (3), 624-630 (2013).
- Yang, Z., et al. Selection of single blastocysts for fresh transfer via standard morphology assessment alone and with array CGH for good prognosis IVF patients: results from a randomized pilot study. Mol Cytogenet. 5 (1), 24 (2012).
- Rubio, C., et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis for aneuploidies in advanced maternal age: a randomized, controlled study. Fertil Steril. 107 (5), 1122-1129 (2017).
- Nguyen, A. L., et al. Identification and characterization of Aurora Kinase B and C variants associated with maternal aneuploidy. Mol Hum Reprod. , (2017).
- Igarashi, H., Knott, J. G., Schultz, R. M., Williams, C. J. Alterations of PLCbeta1 in mouse eggs change calcium oscillatory behavior following fertilization. Dev Biol. 312 (1), 321-330 (2007).
- Database, J. S. E. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. JoVE. , (2017).
- Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 738-742 (2013).
- Armstrong, J. A., Schulz, J. R. . Current Protocols Essential Laboratory Techniques. , (2008).
- Stein, P., Schindler, K. Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment. J Vis Exp. (53), (2011).
- Watanabe, Y. Geometry and force behind kinetochore orientation: lessons from meiosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (6), 370-382 (2012).
- Shuda, K., Schindler, K., Ma, J., Schultz, R. M., Donovan, P. J. Aurora kinase B modulates chromosome alignment in mouse oocytes. Mol Reprod Dev. 76 (11), 1094-1105 (2009).
- Lane, S. I., Yun, Y., Jones, K. T. Timing of anaphase-promoting complex activation in mouse oocytes is predicted by microtubule-kinetochore attachment but not by bivalent alignment or tension. Development. 139 (11), 1947-1955 (2012).
- Nguyen, A. L., et al. Phosphorylation of threonine 3 on histone H3 by haspin kinase is required for meiosis I in mouse oocytes. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5066-5078 (2014).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Dev Biol. 178 (2), 393-402 (1996).
- Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5. Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).
- Jones, K. T., Lane, S. I. Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs. Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).
- Fellmeth, J. E., et al. Expression and characterization of three Aurora kinase C splice variants found in human oocytes. Mol Hum Reprod. 21 (8), 633-644 (2015).
- Rieder, C. L. The structure of the cold-stable kinetochore fiber in metaphase PtK1 cells. Chromosoma. 84 (1), 145-158 (1981).
- Brunet, S., et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase. J Cell Biol. 146 (1), 1-12 (1999).
- Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
