Summary

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Published: April 10, 2018
doi:

Summary

Como as variantes genéticas associadas a doenças humanas começam a tornar-se descoberto, está se tornando cada vez mais importante desenvolver sistemas com os quais rapidamente avaliar o significado biológico dessas variantes identificadas. Este protocolo descreve métodos para avaliar a função do gene humano durante a meiose feminina eu usando oócitos de rato.

Abstract

Aneuploidia embrionária é a genética das principais causas de infertilidade em seres humanos. A maioria destes eventos se originam durante a meiose feminina, e embora positivamente correlacionada com a idade materna, idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Portanto, variantes do gene podem contabilizar segregação do cromossomo incorreta durante a ovogênese. Dado que o acesso aos oócitos humanos é limitado para fins de pesquisa, uma série de ensaios foram desenvolvidos para estudar a função do gene humano durante a meiose I usando oócitos de rato. Primeiro, o RNA mensageiro (mRNA) do gene e variante do gene de interesse são injetadas em oócitos de rato prendi prófase. Após permitir tempo para expressão, oócitos sincronicamente são liberados na maturação meiose para completar a meiose eu. Marcando o mRNA com uma sequência de um repórter fluorescente, tais como a proteína verde fluorescente (Gfp), a localização da proteína humana pode ser avaliada para além das alterações fenotípicas. Por exemplo, ganho ou perda de função pode ser investigada através do estabelecimento de condições experimentais que desafiam o produto do gene para corrigir erros meióticos. Embora este sistema é vantajoso em investigar a função da proteína humana durante a ovogênese, adequada interpretação dos resultados deve ser realizada, dado que a expressão da proteína não está em níveis endógenos e, se não for controlada por (ou seja batido para fora ou para baixo), homologs murino também estão presentes no sistema.

Introduction

Infertilidade é uma condição que afeta 10-15% da população humana da idade reprodutiva 1, dos quais quase metade procura tratamento médico 2. Embora a etiologia da infertilidade é diversa e em muitos casos multifatoriais, a anomalia genética mais comum em seres humanos é embrionário aneuploidia 3. Aneuploidia é definida como o desvio (ganho ou perda) do número correto de cromossomos em uma célula. O fenômeno de aneuploidia em embriões humanos é comum e aumenta com a idade materna avançada, 4,5. Quatro ensaios controlados randomizados evidenciaram o benefício da seleção de embriões (euploid) apenas cromossomicamente normais para transferência uterina porque esta estratégia resultou na implantação de aumento de taxas, menores taxas de aborto e um menor tempo para alcançar a gravidez 6,7,8,9. Portanto, compreender a etiologia da aneuploidia humana pode ter implicações importantes na reprodução assistida.

Embora o teste genético pré-implantação para aneuploidies é benéfica em tratamentos de infertilidade, continua a faltar uma compreensão completa de como originou aneuploidies. É amplamente aceito que existe uma correlação positiva de aneuploidies meióticas (originou-se durante a produção de gametas) e a idade materna, no entanto, algumas taxas de aneuploidia embrionário presente mulheres que desviam a taxa média para sua idade determinada 4. Estes casos sugerem que idade sozinha nem sempre é preditiva do risco de gerar um embrião aneuploid. Outros fatores podem desempenhar um papel no aumento do risco de aneuploidia embrionária, tais como variantes do gene.

Um aspecto fundamental de investigar o potencial de contribuição de uma variante do gene de aneuploidia durante a meiose oócito é projetar um sistema para avaliar rapidamente a função do gene meiótica. Devido a restrições éticas e acesso limitado, é impraticável para realizar esses experimentos usando ovos humanos. Estas questões podem ser contornadas usando oócitos de rato, e aqui uma série de ensaios para avaliar a função do gene humano durante a meiose são descritos. Por microinjecting a codificação do RNA mensageiro (mRNA) para a variante do gene de interesse, a localização da proteína humana no ovo do mouse pode ser visualizada e usada para determinar se a expressão ectópica da proteína humana tipo selvagem e mutante resulta em qualquer alterações fenotípicas que poderiam levar à aneuploidia. Estes fenótipos incluem um aumento no microtúbulos que anexar para o inadequado à irmã cinetócoro e a incapacidade de apoiar o alinhamento de cromossomos em metáfase da meiose I. importante, este protocolo pode ser usado para investigar tanto ganho e perda de função variantes genéticas através do estabelecimento de condições experimentais específicas para desafiar os principais eventos na meiose oócito tais como eixo de alinhamento edifício e cromossomo 10.

Protocol

1. molecular clonagem Obter a sequência de código completo do gene de interesse e o plasmídeo em vitro transcrição (pIVT) vetor11.Nota: Clones de cDNA completos estão comercialmente disponíveis a partir de vários fornecedores ou podem ser gerados através da reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR). Centro Nacional para recursos on-line Biotechnology Information (NCBI) fornece sequências de transcrição de genes do nucleotídeo e sequência e…

Representative Results

Após in vitro transcrição RNA de alta qualidade terão uma relação A260/A280 (1.8-2.2) e um ≥1.7 de relação A260/A230 quando medido utilizando um espectrofotômetro. A imagem na Figura 1 mostra a migração do in vitro-produzido RNA em um gel de agarose a desnaturação, após eletroforese. Uma banda que é manchada no padrão ou uma amostra que tem várias faixas de tamanhos pode indicar a contaminação ou degradação da amostra….

Discussion

Devido a rápida e crescente identificação do humanas variantes genéticas associadas com a doença, é essencial que os sistemas são estabelecidos para avaliar seu significado biológico. Compreensão da função das proteínas na meiose humana coloca desafios específicos porque oócitos humanos são preciosos e raras e humana de esperma não é passíveis de manipulação genética. Oócitos mouse são um sistema de modelo mamíferos valioso para avaliar o gene humano meiótica função 10<s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pesquisa da sociedade americana de medicina reprodutiva e do Charles e Johanna Busch Memorial Fund na Rutgers, Universidade do estado de NJ para Konzen A.L.N. foi apoiada por uma concessão do N.I.H (F31 HD0989597).

Materials

0.2 mL Seal-Rite PCR tube USA Scientific 1602-4300
1 kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0313
100 bp DNA Ladder Thermo Scientific SM0243
6X DNA loading Dye Thermo Scientific R0611
9-well glass spot plate Thomas Scientific 7812G17
Agarose Sigma Aldrich A9539
Albumin from bovine serum  Sigma-Aldrich A3294 
Alexa-fluor-568 conjugated anti-mouse IgG Thermo Scientific A21050 1:200 dilution
Alexa-fluor-633 conjugated anti-human IgG Thermo Scientific A21091 1:200 dilution
Ampicillin VWR AA0356
Anti-vibration table Technical Manufacturing Corp any standard model
Anti-Acetylated Tubulin antibody Sigma Aldrich T7451 1:100 diution
Anti-centromeric (CREST) antibody Antibodies Incorportated 15-234 1:30 dilution 
Barrier (Filter) Pipette tips Thermo Scientific AM12635 Make sure compatable with your brand of pipettors. These are compatible with Eppendorf brand pipettors. 
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Agar, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0445-07-6
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria Bertani) Fisher Scientific DF0446-07-5
Capillary tubing Sutter B100-75-10
Center Well organ culture dish VWR 25381-141
CO2 tank For incubator
Confocal microscope Zeiss any standard model
Centrifuge (With cooling ability) Thomas Scientific any standard model 
Cover Glass 11 x 22 mm Thomas Scientific 6663F10
Coverslips Thomas Scientific 6663-F10 thickness will vary for particular microscopes
DAPI Sigma Aldrich D9542
DEPC H20 Life Technologies AM9922
Digital Dry Bath Thermo Scientific 888700001
Easy A high fidelity cloning enzyme Agilent 600400 For DNA cloning 
Enzymes for linearizing pIVT New England Biolabs NdeI or KasI can be used
Ethidium Bromide Thermo Scientific 155585011
Fluorescent Microscope  Any Fluorescent microscope may be used
Formaldehyde (37%) Thermo Fisher Scientifc 9311
Formaldehyde RNA loading dye Ambion 8552
Frosted Microscope Slides (Uncharged) 25X75 mm Fisher Scientific 12-544-3
Full Length cDNA Clones Can be obtained from any vendor that supplies open reading frame clones
Gel electrophoresis apparatus Bio-Rad any standard model
Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-200
Globin Forward Primer for pIVT Construct 5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.  Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Globin Reverse Primer for pIVT Construct 5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G -3' Can be purchased from any company that generates custom oligonucelotides
Holding pipettes Eppendorf 930001015 Vacutip
Humidified Chamber Tupperware can be used
Illustra Ready-To-Go RT-PCR beads GE Life Sciences 27925901
Incubator any standard model with CO2 and water jacketed technology
Inverted Microscope Nikon instruments Any Standard model
Image J (NIH) Software NIH Image Analysis software
Lid of 96 well plate Nalgene Nunc International 263339
Low Adhesion 0.5 mL microcentrifgue tube USA Scientific 1405-2600
MacVector  MacVector Sequence analysis software
MG132 Selleckchem S2619
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-3 
Millenium RNA Markers-Formaldehyde  Ambion AM7151
Milrinone Sigma-Aldrich M4659 Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral Oil Sigma-Aldrich M5310 Only used embryo-tested, sterile-filtered
Monastrol Sigma-Aldrich M8515 Resuspend in DMSO at 100 mM
Mouthpiece Biodiseno MP-001-Y
N2 tank for antivibration table
Nail Polish; Clear Any clear nailpolish can be used
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific any standard model
NorthernMax 10X Denaturing Gel Buffer Life Technologies AM8676
NorthernMax 10X Running buffer Life Technologies AM8671
NuPAGE MOPS SDS Running buffer Thermo Scnentific NP0001
Organ Culture Dish 60x15mm Life Technologies 08-772-12
Paraformaldehyde Polysciences, Inc.  577773
PCR Thermal Cycler Thermo Fisher Scientific 4484075
Petri Dish 139 mm Thermo Fisher Scientifc 501V
Petri dish 35 mm Thermo Fisher Scientifc 121V
Petri Dish 60 mm Falcon BD 351007
Picoinjector XenoWorks Digital Microinjector any standard model
Pipette puller Flaming-Brown Micropipette puller Model P-1000
pIVT plasmid AddGene 32374 Empty vector suitable for oocyte expression.
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Lee BioSolutions 493-10
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27104 purification of up to 20 uL of plasmid DNA
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Quikchange II site directed mutagenesis kit Agilent  200523 mutagenesis kit for insertions and deletions
Quikchange lightning multi-site directed mutagenesis kit Agilent  210512 mutagenesis kit for single site changes
Scissors (Fine point) Fine science tools 14393
Scissors (Medium point) Fine science tools WP114225
Seal-Rite 1.5 mL microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Slide Warmer any standard model
Spectrophotometer (Nanodrop) Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
Stereomicroscope any standard model
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells Thermo Fisher Scientifc 18265017
Syringe BD Bioscienes 309623 1 ml, 27G(1/2)
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202L
T7 mMessage Machine high-yield capped RNA transcription kit Life Technologies AM1340
TritonX-100 Sigma-Aldrich x-100
Tween-20 Sigma-Aldrich 274348
Tweezer (Fine point- Size 5) Fine science tools SN.743.12.1
UltraPure Dnase/Rnase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientifc 10977015
UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL Thermo Fisher Scientifc 15585011
UVP UV/White lite transilluminator Fisher Scientific UV95041501
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000

References

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Cite This Article
Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, Jr., R. T., Schindler, K. Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I. J. Vis. Exp. (134), e57442, doi:10.3791/57442 (2018).

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