Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali derivati dal: una combinazione di strategia basati su cellule accelerato aspersione con consegna diretta Paracrine
Summary
Per alcuni pazienti, l’unica opzione per la preservazione della fertilità è crioconservazione del tessuto ovarico. Purtroppo, in ritardo il revascularization Mina vitalità follicolare. Qui, presentiamo un protocollo per Co-trapianto di tessuto ovarico umano con le cellule endoteliali per aspersione di utilizzazione come una strategia basata sulle celle che combini accelerato con una consegna di paracrine diretto di molecole bioattive.
Abstract
L’infertilità è un frequente effetto collaterale della chemioterapia e/o radioterapia e per alcuni pazienti, la crioconservazione degli ovociti o embrioni non è un’opzione. In alternativa, un numero crescente di questi pazienti scelgono di crioconservare il tessuto ovarico per autoinnesto dopo il recupero e la remissione. Malgrado i miglioramenti nei risultati fra i pazienti che subiscono il auto-trapianto di tessuto ovarico crioconservati, efficiente rivascolarizzazione del tessuto innestato rimane un ostacolo importante. Per mitigare l’ischemia e quindi migliorare i risultati in pazienti sottoposti a trapianto di auto, abbiamo sviluppato una strategia basata su cellule vascolare per accelerare l’aspersione del tessuto ovarico. Descriviamo un metodo per Co-trapianto di cellule endoteliali esogene (dirigenti) con tessuto ovarico crioconservati in un modello di xenotrapianto di topo. Estendiamo questo approccio per impiegare i dirigenti che sono stati progettati per esprimono costitutivamente ormone antimulleriano (AMH), consentendo in tal modo paracrino sostenuta segnalazione ingresso agli innesti ovarici. Co-trapianto con ExECs aumentato volume follicolare e lo sviluppo di follicoli antrali migliorata e AMH-esprimendo ExECs promosso ritenzione di quiescenza follicoli primordiali. Questa strategia combinata può essere uno strumento utile per ridurre l’ischemia e modulando l’attivazione follicolare nel contesto di preservazione della fertilità e/o sterilità nel suo complesso.
Introduction
Il cancro rimane tra le principali cause di morte nel mondo sviluppato, ma decenni di ricerca hanno prodotto progressi significativi per la maggior parte dei tipi di cancro e in alcuni casi quasi raddoppiata sopravvivenza tariffe1. Purtroppo, gli agenti chemioterapeutici sono spesso gonadotossica, che riducono la riserva di follicoli primordiali nelle ovaie e la riduzione di fertilità2. Questa popolazione in crescita possa beneficiare di vari metodi di conservazione della fertilità compreso la crioconservazione degli ovociti e/o embrione, tuttavia, i pazienti che richiedono l’inizio rapido della terapia del cancro e pre-puberali pazienti sono idonei per queste opzioni. In alternativa, alcuni pazienti hanno scelto di crioconservare il tessuto ovarico prima di intraprendere il loro regime terapeutico e al momento di recupero e la remissione, auto-trapianto di tessuto per ripristinare la fertilità3. Eppure, ad oggi, sopravvivenza dell’innesto e follicolare uscita auto-trapianto seguente rimangono relativamente basso4, principalmente a causa del tessuto ischemia e l’ipossia5,6,7. Nonostante i numerosi sforzi per migliorare la vitalità degli innesti di corticale ovarici con anti-ossidanti8,9, pro-angiogenica citochine10,11,12,1 3, o manipolazioni meccaniche14, ischemia dell’innesto in un post-trapianto di 5 a 7 giorno finestra compromette la vitalità e la sopravvivenza del trapianto7. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una strategia basata su cellulare per facilitare l’anastomosi dei vasi host e dell’innesto e accelerare così la riperfusione del tessuto ovarico.
Oltre l’insulto ischemico di tessuto ovarico innestato nella finestra del post-trapianto, la rottura della segnalazione Inter-follicolare può contribuire allo svuotamento della piscina15,16. Poiché le cellule endoteliali esogene (dirigenti) contribuiscono ai vasi stabile e funzionante nella periferia dell’innesto, presentano un’opportunità unica per trasmettere un input molecolare definito al tessuto trapiantato. Come prova di principio, dirigenti sono stati progettati per esprimere Super-fisiologici livelli di ormone antimulleriano (AMH), un membro della superfamiglia beta (TGFβ) fattore di crescita trasformante che è stato indicato per limitare la crescita follicolare17. Confronto di distribuzione follicolare negli innesti co-trapiantati con cellule esprimenti AMH e controllo verifica l’attività biologica e la potenza dei dirigenti ingegnerizzati.
In sintesi, migliorando l’innesto attuabilità e sopprimendo la mobilizzazione precoce del pool follicolare, questo approccio può aumentare la produttività di auto-trapianto di tessuto ovarico in pazienti che subiscono la preservazione della fertilità. Inoltre, la piattaforma basata su ExEC consente sperimentale interrogatorio dei regolatori molecolari che sono stati implicati nello sviluppo follicolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui dimostriamo che co-trapianti di dirigenti fornisce un beneficio significativo alla vitalità del tessuto ovarico e funzione a seguito dello xenotrapianto nei topi. Norme per l’applicazione clinica di auto-trapianto di tessuto ovarico per la preservazione della fertilità non sono stati insieme e i parametri ottimali (dimensioni, sito di trapianto, durata di innesto, ecc.) 32 , 33 , 34 per maggiore recupero del pool …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Omar Alexander Man per le illustrazioni.
L.M. era sostenuto da un pilota Award dalla clinica di Cornell e traduzione Science Center e un ASRM Assegnista di ricerca.
Gli autori vorrei ringraziare i membri del laboratorio di James per lettura critica del manoscritto.
Materials
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 11415064 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | Anti-Anti X100 |
| Sucrose | Sigma | S 1888 | |
| Fibrinogen | Sigma | F 8630 | from bovine plasma |
| Thrombin | Sigma | T 1063 | from human plasma |
| DMSO | Sigma | D 2650 | |
| DMEM | Gibco | 12491015 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Invitrogen | 00-4555-56 | Accutase |
| Plastic paraffin film | Bemis NA | Parafilm M | |
| Surgical paper tape 2.5 cm | 3M | 1530-1 | Micropore |
| Surgical Paper tape 1.25 cm | 3M | 1530-0 | Micropore |
| Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm | 3M | 1527-0 | Transpore |
| Monofilament Absorbable Suture | Covidien | UM-203 | Biosyn |
| Braided Absorbable Suture | Covidien | GL-889 | Polysorb |
| Povidone-iodine Solution USP 10% | Purdue Products | 67618-153-01 | Betadine Solution Swab Stick |
| Cryoviales | Nunc | 377267 | CryoTube |
| sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Puralube |
| 1.7 ml micro-centrifuge tube | Denville | C-2172 | Eppendorf |
| Anasthesia system | VetEquip | V-1 table top system with scavenging | |
| Endothelial cells | Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA | Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells | |
| Trichrome stain | Sigma | HT15-1kt | Trichrome Stain (Masson) Kit |
| Isolectin | Invitrogen | I32450 | isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate |
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