Co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais engenharia: uma combinação de estratégia baseada em célula acelerado perfusão com entrega direta parácrina
Summary
Para alguns pacientes, a única opção para preservação de fertilidade é a criopreservação de tecido ovariano. Infelizmente, revascularização atrasada prejudica a viabilidade folicular. Aqui, apresentamos um protocolo para co transplante de tecido ovariano humano com células endoteliais para utilização como uma estratégia baseada em célula combinando acelerada perfusão com uma entrega parácrina direto de moléculas bioativas.
Abstract
Infertilidade é um efeito colateral frequente da quimioterapia e/ou radioterapia e para alguns pacientes, criopreservação de oócitos ou embriões não é uma opção. Como alternativa, um número crescente destes pacientes está optando por cryopreserve tecido ovariano para autoenxerto após recuperação e remissão. Apesar das melhorias em termos de resultados entre os pacientes submetidos a autotransplante de tecido ovariano criopreservado, revascularização eficiente do tecido enxertado continua a ser um grande obstáculo. Para atenuar a isquemia e, assim, melhorar os resultados em pacientes submetidos a autotransplante, desenvolvemos uma estratégia baseada em célula vascular para acelerar a perfusão do tecido ovariano. Nós descrevemos um método para co transplante de células endoteliais exógenas (executivos) com tecido ovariano criopreservado em um modelo de enxerto heterólogo do rato. Estendemos essa abordagem para empregar os executivos que têm sido projetados para expressar constitutivamente hormônio Anti-Mulleriano (AMH), permitindo assim sustentada parácrina sinalizando a entrada para enxertos ovarianos. Transplante co com executivos aumentou volume folicular e desenvolvimento folicular antral melhorada e AMH-expressando executivos promovido retenção dos folículos primordiais quiescentes. Essa estratégia combinada pode ser uma ferramenta útil para atenuar a isquemia e modulando a ativação folicular no contexto da preservação da fertilidade e/ou infertilidade em geral.
Introduction
Câncer permanece entre as principais causas de morte no mundo desenvolvido, no entanto, décadas de pesquisa produziram um progresso significativo para a maioria dos tipos de câncer e em alguns casos quase duplicou de sobrevivência taxas1. Infelizmente, agentes quimioterapêuticos são frequentemente gonadotoxic, esgotando a reserva de folículos primordiais nos ovários e redução da fertilidade2. Este crescimento da população pode se beneficiar de vários métodos de preservação da fertilidade, incluindo criopreservação de ovócitos e/ou embrião, no entanto, pacientes que necessitam de iniciação rápida da terapia do câncer e pacientes pré-púberes são inelegíveis para essas opções. Como alternativa, alguns pacientes têm escolhido para cryopreserve tecido ovariano, antes de empreender o seu regime terapêutico e sobre recuperação e remissão, autotransplante de tecido para restaurar a fertilidade3. Ainda, até à data, sobrevivência do enxerto e folicular saída seguindo autotransplante permanecem relativamente baixos4, principalmente devido ao tecido isquemia e hipóxia5,6,7. Apesar de inúmeros esforços para melhorar a viabilidade do enxerto cortical ovariana usando anti-oxidantes8,9, pro-angiogênico citocinas10,11,12,1 3, ou manipulações mecânicas14, isquemia de enxerto em pós-transplante uma janela de 5 a 7 dia põe em causa a viabilidade e sobrevivência do enxerto7. Para resolver isso, nós desenvolvemos uma estratégia baseada em célula para facilitar a anastomose dos vasos host e enxerto e, portanto, apressar a reperfusão do tecido ovariano.
Além o insulto isquêmico ao tecido ovariano transplantado na janela pós-transplante, o rompimento de sinalização inter folicular pode contribuir ao esgotamento do pool15,16. Porque as células endoteliais exógenas (executivos) contribuem para navios estáveis e funcionando na periferia do enxerto, eles apresentam uma oportunidade única para transmitir uma entrada molecular definida para tecido transplantado. Como prova de princípio, os executivos foram projetados para níveis expressam super fisiológicos do hormônio Anti-Mulleriano (AMH), um membro da superfamília transformadora para a beta (TGFβ) fator de crescimento que tem sido mostrado para restringir o crescimento folicular17. Comparação da distribuição folicular em enxertos co transplantado com células AMH-expressando e controle verifica a atividade biológica e a potência de executivos de engenharia.
Em resumo, melhorando o enxerto viabilidade e suprimindo a mobilização precoce do pool folicular, esta abordagem pode aumentar a produtividade de autotransplante de tecido ovariano em pacientes submetidos à preservação da fertilidade. Além disso, a plataforma baseada em ExEC permite interrogatório experimental de reguladores moleculares que têm sido implicados no desenvolvimento folicular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui podemos demonstrar esse transplante co de executivos fornece um benefício significativo a viabilidade do tecido ovariano e função após enxerto heterólogo em camundongos. Normas para a aplicação clínica da autotransplante de tecido ovariano para preservação da fertilidade não foram conjunto e os parâmetros ideais (tamanho, local de transplante, duração do enxerto, etc.) 32 , 33 , 34 para recuperação …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Omar Alexander Man para as ilustrações.
L.M. foi apoiado por um prêmio de piloto da clínica Cornell e concessão de pesquisa Translational Science Center e um ASRM.
Os autores gostaria de agradecer aos membros do laboratório James para uma leitura crítica do manuscrito.
Materials
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 11415064 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | Anti-Anti X100 |
| Sucrose | Sigma | S 1888 | |
| Fibrinogen | Sigma | F 8630 | from bovine plasma |
| Thrombin | Sigma | T 1063 | from human plasma |
| DMSO | Sigma | D 2650 | |
| DMEM | Gibco | 12491015 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Invitrogen | 00-4555-56 | Accutase |
| Plastic paraffin film | Bemis NA | Parafilm M | |
| Surgical paper tape 2.5 cm | 3M | 1530-1 | Micropore |
| Surgical Paper tape 1.25 cm | 3M | 1530-0 | Micropore |
| Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm | 3M | 1527-0 | Transpore |
| Monofilament Absorbable Suture | Covidien | UM-203 | Biosyn |
| Braided Absorbable Suture | Covidien | GL-889 | Polysorb |
| Povidone-iodine Solution USP 10% | Purdue Products | 67618-153-01 | Betadine Solution Swab Stick |
| Cryoviales | Nunc | 377267 | CryoTube |
| sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Puralube |
| 1.7 ml micro-centrifuge tube | Denville | C-2172 | Eppendorf |
| Anasthesia system | VetEquip | V-1 table top system with scavenging | |
| Endothelial cells | Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA | Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells | |
| Trichrome stain | Sigma | HT15-1kt | Trichrome Stain (Masson) Kit |
| Isolectin | Invitrogen | I32450 | isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
- Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
- Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
- Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
- Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
- Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
- Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
- Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
- Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
- Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
- Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
- Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
- Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475 (2011).
- Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
- Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
- Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, 13-17 (2014).
- Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
- Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
- Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
- Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology?. Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
- Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
- Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
- Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
- Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
- Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
- Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
- Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
- Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
- Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
- Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
- Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
- Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and ‘burn-out’ contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003 (2015).
- Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
- Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
- Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
- Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
- Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and “burnout”; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162 (2013).
- Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).
