Kvantificering af intracellulære vækst inde makrofager er en holdbar og pålidelig metode til vurdering af virulens i Leishmania parasitter
Summary
Alle patogene Leishmania arter opholde sig og replikere indeni makrofager i deres hvirveldyr værter. Vi præsenterer her, en protokol for at inficere murine knoglemarv-afledte makrofager i kultur med Leishmania, efterfulgt af præcis kvantificering af intracellulære vækst kinetik. Denne metode er nyttig til at studere individuelle faktorer, der påvirker vært-patogen interaktion og Leishmania virulens.
Abstract
Livscyklus af Leishmania, det agens af leishmaniasis, veksler mellem promastigote og amastigote stadier i insekt og hvirveldyr værter, henholdsvis. Mens patogene symptomer med leishmaniasis kan variere meget, fra benigne kutane læsioner meget dødelig visceral sygdom former dyrearten infektiøst alle Leishmania arter opholder sig inde i værten makrofager i hvirveldyr fase af deres livscyklus. Leishmania smitteevne er derfor direkte relateret til dens evne til at invadere, overleve og replikere inden for parasitophorous vacuoles (PVs) inde i makrofager. Således fungerer vurderingen af parasittens evne til at replikere intracellulært som en pålidelig metode til bestemmelse af virulens. At studere leishmaniasis udvikling ved hjælp af dyremodeller er tidskrævende, besværligt og ofte vanskelige, især med de pathogenically vigtigt visceral former. Vi beskriver her en metode til at følge den intracellulære udvikling af Leishmania i knoglemarv-afledte makrofager (BMMs). Intracellulære parasit numre bestemmes med 24 timers mellemrum i 72-96 timer efter infektion. Denne metode giver mulighed for en pålidelig bestemmelse af virkningerne af forskellige genetiske faktorer på Leishmania virulens. Som et eksempel viser vi, hvordan et enkelt allel sletning af Leishmania mitokondrie jern Transporter-genet (LMIT1) forringer Leishmania amazonensis mutant stamme LMIT1/ΔLmit1 evne til at vokse inde i BMMs, afspejler en drastisk reduktion i virulens i forhold til wild-type. Denne analyse giver også mulighed for præcis styring af forsøgsbetingelser, der individuelt kan manipuleres til at analysere forskellige faktorer (næringsstoffer, reaktive ilt arter, osv.) indflydelse på vært-patogen interaktion. Derfor, passende udførelse og kvantificering af BMM infektion undersøgelser giver en non-invasiv, hurtig, økonomisk, sikker og pålidelig alternativ til konventionel dyr model undersøgelser.
Introduction
Leishmaniasis refererer til et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker forårsaget af protozoer parasit arter af slægten Leishmania. Ca. 12 millioner mennesker smittes i øjeblikket med Leishmania på verdensplan, og mere end 350 millioner er truet. Sygdom patologi afhænger af arternes Leishmania og vært faktorer og symptomer varierer fra uskadelige selvhelende hudlæsioner dødbringende visceralizing former. Hvis ubehandlet, visceral leishmaniasis er dødelig, ranking kun efter malaria som de dødeligste sygdom hos mennesker forårsaget af infektion med protozoer parasitten1. På trods af de vidtrækkende forskelle i sygdom patologi og symptomer har alle Leishmania arter en digenic liv-cyklus vekslende mellem promastigote og amastigote stadier i insekt og hvirveldyr værter, henholdsvis. Indersiden hvirveldyr, Leishmania target host makrofager for invasion og inducere dannelse af parasitophorous vacuoles (PVs), sure segmenter med egenskaberne for phagolysosomes hvor de stærkt virulente amastigote former replikere. Amastigotes vedvarer i værten væv under kroniske infektioner og kan være bestået frem til ikke-inficerede sandfluer, fuldfører transmission cyklus. Derfor, i forbindelse med udvikling af human sygdom, amastigotes er den vigtigste Leishmania lifecycle form2. Undersøge hvordan amastigotes replikere indeni makrofag PVs er afgørende for forståelse Leishmania virulens3,4,5,6,7 og for den udvikling af nye effektive behandlinger.
Vi beskriver her en metode, der bruges regelmæssigt af vores laboratorium til at studere Leishmania infektion og replikering i knoglemarv-afledte makrofager (BMMs), der involverer kvantitative vurdering af antallet af intracellulære Leishmania over tid. Processen indebærer høst af monocytter fra mus knoglemarven og differentiering til makrofager i kultur, in vitro- smitte med infektiøs former (metacyclic promastigotes eller amastigotes) Leishmania og kvantificering af den antallet af intracellulære parasitter på hver 24 h interval for en periode på 72-96 h efter infektion. Denne analyse har været brugt i vores laboratorium til at bestemme virkningen af flere miljømæssige faktorer og parasit gener, herunder identifikation af jern kritiske rolle i at fremme L. amazonensis virulens, der yderligere blev valideret af footpad læsion udviklingsstudier mus6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle patogene Leishmania arter fastsætte deres replicative niche inde i værten makrofager, kan dette assay anvendes universelt til virulens bestemmelser i alle Leishmania arter.
Udfører BMM infektioner giver mulighed for analyse af vært-parasit interaktioner på enkelt celle-niveau, og dermed en mere omfattende forståelse af hvordan Leishmania parasitter interagerer med deres foretrukne vært mikromiljø, PVs af makrofager. Makrofag infektion assays er blevet med held brugt af flere grupper16,17,18,19,20,21,22 at udforske funktioner af både vært makrofager og Leishmania specifikke gener og deres potentielle inddragelse i det komplekse samspil, der kendetegner intracellulære infektion. BMM infektioner giver mulighed for kvantificering af parasitten vækst som en udlæsning af virkningen af vært faktorer, der påvirker intracellulære overlevelse, som microbicidal nitrogenoxid produktion, generation af reaktive ilt arter og andre ugunstige forhold stødt inde i lysosomet-lignende PVs23. Makrofag infektion assays har også været udnyttet til at identificere potentielle anti-leishmanial medicin kundeemner for terapeutisk udvikling13,24.
In vitro- arten af BMM infektioner giver flere fordele sammenlignet med andre metoder til at vurdere Leishmania virulens. Flere tidligere studier undersøger mekanismer af intracellulære parasit overlevelse over tid dog ikke kvantificere infektion som en sats20,21,24. Desuden, mange undersøgelser fokuseret på efter i vivo infektioner over tid gjorde det ved at måle kutan læsion størrelse og andre fysiologiske symptomer, der er kun indirekte relateret til parasit replikering25,26 , 27. in vivo infektion er en stringent tilgang til at vurdere parasit virulens, men læsion størrelse målinger baseret på footpad hævelse alene er ofte utilstrækkelige, da de afspejler det inflammatoriske respons i inficeret væv og ikke den absolutte antal af parasitter. Af denne grund, footpad læsion udvikling assays skal følges ved kvantificeringen af parasitten belastning inficeret væv, en procedure, der kræver lange begrænsende fortynding-undersøgelser,28. Desuden, indebærer i vivo undersøgelser ofte, at ofre flere dyr på forskellige punkter i tid til at udtrække væv af interesse6,8,9,10, 11 , 13. derimod stort antal BMMs kan fås fra bare ét dyr, og disse celler kan være forgyldt betingelser, som tillader vurdering af infektion på forskellige punkter i tid. Derudover giver sammenlignes i vivo undersøgelser, udfører in vitro- BMM infektioner større kontrol over forsøgsbetingelser. Kvantificere makrofager at blive smittet med parasitter, selv giver præcis kontrol over mangfoldigheden af infektion (MOI) og dyrkningsbetingelserne. Fin kontrol over disse faktorer kan være nøglen til at identificere karakteristika af diskrete cellulære veje og forstå deres indflydelse på forløbet af infektionen.
Disse fordele er det noget overraskende, at meget få grupper at studere Leishmania virulens hidtil har taget fuld fordel af kvantitativ evaluering af intracellulær replikation i makrofager. I denne artikel vil diskutere vi fælles faldgruber, der kan være hæmmer de mere omfattende udnyttelse af denne analyse, og give en trinvis protokol for at lette dets korrekte gennemførelse. I betragtning af dens præcision og alsidighed, BMM infektion analysen vi beskrive her kan ikke kun udnyttes til at udforske vært-patogen interaktioner påvirke Leishmania virulens, men også at studere andre mikroorganismer, der replikerer inde makrofager29. Vigtigere, kan dette assay også udvikles som en hurtig og økonomisk præklinisk screeningsmetode for anti-leishmanial medicin udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
De kvantitative data produceret af BMM infektion assay beskrevet ovenfor, giver mulighed for efterforskerne at indhente priser af infektion og en pålidelig bestemmelse af ændringer i virulens egenskaber i en relativt kortere tidsperiode (maksimalt 2 uger, i forhold til 2 måneder kræves for i vivo forsøg). Denne metode bygger på DNA specifikke farvestoffet DAPI, som specifikt pletter makrofag og parasit kerner, og giver mulighed for hurtig identifikation og kvantificering af inficerede celler. I sammenligni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af nationale kontorer i sundhed grant RO1 AI067979 til NWA.
Gitte er modtager af bachelorstuderende stipendium fra Howard Hughes Medical Institute/universitetet af Maryland College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
