Kvantifisering av intracellulær vekst i makrofager er en rask og pålitelig metode for å vurdere virulens av Leishmania parasitter
Summary
Alle sykdomsfremkallende Leishmania arter ligge og gjenskape i makrofager av deres virveldyr verter. Her presenterer vi en protokoll for å infisere murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager i kultur med Leishmania, etterfulgt av presise kvantifisering av intracellulær vekst kinetics. Denne metoden er nyttig for studerer individuelle faktorer som påvirker vert-patogen samhandling og Leishmania virulens.
Abstract
Livssyklusen til Leishmania, den utløsende agenten for leishmaniasis, veksler mellom promastigote og amastigote stadier i insekt og virveldyr verter, henholdsvis. Mens patogene symptomer på leishmaniasis kan variere mye, fra godartet kutan lesjoner til svært dødelig visceral sykdom former avhengig av infeksiøs arter, bor alle Leishmania arter inne vert makrofager under virveldyr Stadium i livssyklusen. Leishmania infectivity er derfor direkte knyttet til sin evne til å invadere overleve og gjenskape innen parasitophorous vacuoles (PV) i makrofager. Derfor fungerer vurdere parasittens evne til å reprodusere intracellulært som en pålitelig metode for å bestemme virulens. Studere leishmaniasis utvikling med dyremodeller er tidkrevende, kjedelig og ofte vanskelig, spesielt med pathogenically viktig visceral skjemaer. Her beskriver vi en metodikk følge intracellulær utviklingen av Leishmania i Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs). Intracellulær parasitten tall bestemmes i 24-timers intervaller på 72-96 h etter infeksjon. Denne metoden gir et pålitelig fastsettelse av virkningene av ulike genetiske faktorer på Leishmania virulens. Som et eksempel viser vi hvordan en enkelt allelet sletting av Leishmania mitokondrie jern Transporter genet (LMIT1) svekker evnen til Leishmania amazonensis mutert stamme LMIT1/ΔLmit1 å vokse i BMMs, reflekterer en drastisk reduksjon i virulens sammenlignet med vill-type. Denne analysen kan også nøyaktig kontroll over eksperimentelle forhold, som kan redigeres individuelt analysere påvirkning av ulike faktorer (næringsstoffer, reaktive oksygen arter, osv.) på verten-patogen samhandlingen. Derfor gir riktig gjennomføring og kvantifisering BMM infeksjon studiene en ikke-invasiv, rask, økonomisk, sikker og pålitelig alternativ til konvensjonelle dyremodell studier.
Introduction
Leishmaniasis refererer til et bredt spekter av menneskelige sykdommer forårsaket av protozoan parasitten arter av slekten Leishmania. Ca 12 millioner mennesker er nå infisert med Leishmania over hele verden mer enn 350 millioner er utsatt. Sykdom patologi avhenger av den Leishmania arten og vert faktorer og symptomene varierer fra ufarlige selvhelbredende hudlesjoner dødelige visceralizing former. Hvis ubehandlet, visceral leishmaniasis er kritisk, rangering etter malaria som dødeligste menneskelig sykdom forårsaket av infeksjon med en protozoan parasitten1. Til tross for omfattende forskjellene i sykdom patologi og symptomer har alle Leishmania arter en digenic livssyklus alternerende mellom promastigote og amastigote stadier i insekt og virveldyr verter, henholdsvis. Innsiden virveldyr, Leishmania målet vert makrofager for invasjonen og indusere dannelsen av parasitophorous vacuoles (PV), surt deler med egenskapene til phagolysosomes der skjemaene svært virulente amastigote gjenskape. Amastigotes vedvarer i vert vev under kroniske infeksjoner og kan sendes frem til uninfected sandflies, fullføre overføring syklusen. Derfor, i sammenheng med menneskelig sykdom utvikling, amastigotes er den viktigste Leishmania livssyklus skjema2. Undersøker hvordan amastigotes gjenskape inne macrophage PVs er avgjørende for å forstå Leishmania virulens3,4,5,6,7 og for den utviklingen av romanen effektiv terapi.
Her beskriver vi en metode jevnlig brukt av vårt laboratorium Leishmania infeksjon og replikasjon i bein margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs), som involverer kvantitativ vurdering av antall intracellulær Leishmania over tid. Prosessen innebærer høsting av monocytter fra musen benmargen og differensiering makrofager i kultur, i vitro infeksjon med infeksiøs skjemaer (metacyclic promastigotes eller amastigotes) av Leishmania og måling av den antall intracellulære parasitter på 24-timers intervall for en periode på 72-96 timer etter infeksjon. Denne analysen er brukt i vårt laboratorium for å fastslå effekten av flere miljøfaktorer og parasitten gener, inkludert identifisering av kritiske rollen av jern i å fremme L. amazonensis virulens som ble ytterligere validert av footpad lesjonen development studier i mus6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Siden alle sykdomsfremkallende Leishmania arter etablere sin replicative nisje inne vert makrofager, kan denne analysen brukes universelt for virulens avgjørelser i alle Leishmania arter.
Utføre BMM infeksjoner kan analyse av vert-parasitten samhandlinger på enkeltcelle nivå, og dermed en mer omfattende forståelse av hvordan Leishmania parasitter samhandler med sine foretrukne vert microenvironment, PVs av makrofager. Macrophage infeksjon analyser har blitt brukt av flere grupper16,17,18,19,20,21,22 å utforske funksjonene i både vert macrophage og Leishmania bestemte gener og deres potensielle engasjement i det komplekse samspillet som karakteriserer intracellulær infeksjon. BMM infeksjoner tillate kvantifisering av parasitten vekst som en skrivebeskyttet ut av virkningen av vert faktorer som påvirker intracellulær overlevelse, som microbicidal nitrogenoksid produksjonen, generasjon av frie radikaler og andre ugunstige forhold oppdaget i lysosome-lignende PVs23. Macrophage infeksjon analyser har også blitt benyttet for å identifisere potensielle anti-leishmanial narkotika leder for terapeutisk utvikling13,24.
Natur i vitro BMM infeksjoner gir flere fordeler sammenlignet med andre metoder for å vurdere Leishmania virulens. Imidlertid flere tidligere studier som har undersøkt virkningsmekanismer intracellulær parasitten overlevelse over tid ikke tallfeste infeksjon som en pris20,21,24. Dessuten, mange studier fokuserte på følgende i vivo infeksjoner over tid gjorde det ved å måle kutan lesjon størrelse og andre fysiologiske symptomer som gjelder bare indirekte parasitten replikering25,26 , 27. i vivo infeksjon er en strenge tilnærming til vurdere parasitten virulens, men lesjon størrelse målinger basert på footpad hevelse alene er ofte utilstrekkelig, som gjenspeiler de inflammatorisk respons i infiserte vev og ikke den absolutte antallet parasitter. Derfor footpad lesjon utvikling analyser må etterfølges av kvantifisering av parasitten lasten i infiserte vev, søk en prosedyre som krever lange begrensende fortynning28. I tillegg innebære i vivo studier ofte at flere dyr på ulike tidspunkter i tid for å pakke ut vev av interesse6,8,9,10, 11 , 13. derimot store antall BMMs kan fås fra ett dyr, og disse cellene kan være belagt under forhold som tillater vurdering av infeksjon på ulike punkter i tid. Videre gir sammenlignet med i vivo studier, utfører i vitro BMM infeksjoner større kontroll over eksperimentelle forhold. Kvantifisere makrofager er infisert med parasitter selv tillater presis kontroll over mangfoldet av infeksjon (MOI) og kultur forhold. Bedre kontroll over disse faktorene kan være nøkkelen identifiserende kjennetegn av diskrete mobilnettet og forstå deres innvirkning på løpet av infeksjon.
Gitt disse fordelene, er det noe overraskende at få grupper studere Leishmania virulens hittil har tatt full nytte av kvantitativ vurdering av intracellulær replikering i makrofager. I denne artikkelen diskutere vi felles fallgruver som kan være hindrer den mer omfattende utnyttelsen av denne analysen, og gi en trinnvis protokoll for å gjøre gjennomføringen riktig. Vurderer sin presisjon og allsidighet, BMM infeksjon analysen beskriver vi her kan ikke bare benyttes å utforske vert-patogen interaksjoner påvirker Leishmania virulens, men også å studere andre mikroorganismer som gjenskaper inne makrofager29. Viktigere, kan denne analysen også bli utviklet som en rask og økonomisk pre-klinisk screening metode for anti-leishmanial narkotika utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvantitative data produsert av BMM infeksjon analysen beskrevet ovenfor, gjør etterforskere utbredelsen av smitte og pålitelig beslutning av endringer i virulens egenskaper i en relativt kortere tidsperiode (maksimalt 2 uker, sammenlignet med 2 måneder kreves for i vivo eksperimenter). Denne metoden er avhengig av DNA bestemt fargestoff DAPI, som spesielt flekker macrophage og parasitt kjerner, og tillater rask identifikasjon og måling av infiserte celler. Sammenligning binde andre flekker som Giemsa til et …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant RO1 AI067979 til NWA.
Novotel er mottaker av undervisning fellesskap fra Howard Hughes Medical Institute/Universitetet i Maryland College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
