Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania
Summary
Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all’interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l’interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .
Abstract
Il ciclo di vita di Leishmania, l’agente eziologico della leishmaniosi, alterna fasi promastigote ed amastigote all’interno l’insetto e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Mentre patogeni sintomi della leishmaniosi possono variare ampiamente, da lesioni cutanee benigne a forme altamente fatale malattia viscerale a seconda della specie infettiva, tutte le specie di Leishmania risiedono all’interno di host macrofagi durante la fase di vertebrati di il ciclo di vita. Leishmania infettività pertanto è direttamente correlata alla sua capacità di invadere, sopravvivere e replicare all’interno di vacuoli parasitophorous (PVs) all’interno dei macrofagi. Così, valutando la capacità del parassita di replicare intracellulare serve come un metodo affidabile per determinare la virulenza. Studiare lo sviluppo di leishmaniosi utilizzando modelli animali è lungo, noioso e spesso difficile, specialmente con il patogeno importante forme viscerali. Descriviamo qui una metodologia per seguire lo sviluppo intracellulare di Leishmania in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi). Parassita intracellulare numeri sono determinati a intervalli di 24 h per 72-96 ore dopo l’infezione. Questo metodo consente una determinazione affidabile degli effetti di vari fattori genetici sulla virulenza di Leishmania . Ad esempio, mostriamo come un’omissione di singolo allele del gene del trasportatore mitocondriale di ferro Leishmania (LMIT1) altera la capacità del ceppo mutante Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 a crescere all’interno di saggi, riflettendo una drastica riduzione nella virulenza rispetto al wild type. Questo test consente inoltre un controllo preciso delle condizioni sperimentali, che possono essere manipolati individualmente per analizzare l’influenza di vari fattori (nutrienti, specie reattive dell’ossigeno, ecc.) sull’interazione ospite-patogeno. Pertanto, l’esecuzione appropriata e la quantificazione degli studi infezione BMM forniscono un’alternativa non invasiva, veloce, economica, sicura e affidabile agli studi di modello animali convenzionali.
Introduction
La leishmaniosi si riferisce ad un ampio spettro di malattie umane causate da specie di protozoo parassita del genere Leishmania. Circa 12 milioni di persone sono attualmente infettati con Leishmania in tutto il mondo, e più di 350 milioni sono a rischio. La patologia della malattia dipende dalla specie di Leishmania e fattori dell’ospite, e sintomi variano da lesioni cutanee autorigenerante innocuo a forme visceralizing letali. Se non trattata, viscerale di leishmaniosi è fatale, classifica solo dopo la malaria come la più letale malattia umana causata tramite l’infezione con un protozoo parassita1. Nonostante le differenze ad ampio raggio in patologia di malattia ed i sintomi, tutte le specie di Leishmania hanno un ciclo di vita digenica alternando fasi promastigote ed amastigote all’interno insetti e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Interno vertebrati, Leishmania macrofagi host per invasione di destinazione e inducono la formazione di vacuoli parasitophorous (PVs), compartimenti acidi con proprietà di phagolysosomes dove le forme altamente virulento amastigote replicano. Amastigoti persistono nei tessuti dell’ospite durante le infezioni croniche e possono essere passate avanti a non infetti Pappataci, completando il ciclo di trasmissione. Pertanto, nel contesto dello sviluppo di malattia umana, amastigoti sono i più importanti di forma di Leishmania del ciclo di vita2. Indagando come amastigoti replicano all’interno del macrofago PVs è fondamentale per la comprensione Leishmania virulenza3,4,5,6,7 e per la sviluppo di nuove terapie efficaci.
Descriviamo qui un metodo utilizzato regolarmente dal nostro laboratorio per studiare la Leishmania infezione e la replicazione in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi), che comporta la valutazione quantitativa del numero di intracellulare Leishmania nel corso del tempo. Il processo prevede la raccolta dei monociti da midollo osseo di topo e la differenziazione di macrofagi nella cultura, infezione in vitro con forme infettive (metacyclic promastigotes o amastigotes) di Leishmania e quantificazione della numero di parassiti intracellulari ad ogni intervallo di 24 ore per un periodo di 72-96 h dopo l’infezione. Questo test è stato utilizzato nel nostro laboratorio per determinare l’impatto di diversi fattori ambientali e geni di parassita, compresa l’individuazione del ruolo critico di ferro nel promuovere L. amazonensis virulenza che più ulteriormente è stata convalidata da zampa studi di sviluppo di lesione in topi6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Poiché tutte le specie patogene di Leishmania stabiliscono loro nicchia replicativa dentro macrofagi host, questo test può essere utilizzato universalmente per le determinazioni di virulenza in tutte le specie di Leishmania .
L’esecuzione di infezioni BMM consente analisi delle interazioni ospite-parassita a livello di singola cellula e quindi una più ampia comprensione di come i parassiti di Leishmania interagiscono con loro microambiente ospite preferito, il PVs dei macrofagi. Macrofago infezione saggi sono stati utilizzati con successo da più gruppi16,17,18,19,20,21,22 per esplorare funzioni del macrofago host e Leishmania specifici geni e di loro possibili implicazioni nella complessa interazione che caratterizza l’infezione intracellulare. Le infezioni BMM permetterà la quantificazione della crescita del parassita come una lettura dell’impatto dei fattori dell’ospite che influenzano la sopravvivenza intracellulare, come produzione di ossido nitrico microbicida, generazione di specie reattive dell’ossigeno e altre condizioni avverse ha rilevato all’interno del lysosome-come PVs23. Saggi di infezione del macrofago inoltre sono stati utilizzati per identificare potenziali contatti di droga di anti-leishmanial per sviluppo terapeutico13,24.
La natura in vitro delle infezioni BMM fornisce parecchi vantaggi sopra altri metodi per valutare la virulenza di Leishmania . Tuttavia, diversi studi precedenti, esaminare i meccanismi di sopravvivenza del parassita intracellulare nel corso del tempo non ha fatto quantificare l’infezione come un tasso20,21,24. Inoltre, molti studi focalizzati sulle seguenti infezioni in vivo nel corso del tempo ha fatto misurando la dimensione della lesione cutanea e altri sintomi fisiologici che sono solo indirettamente collegati ad parassita replica25,26 , 27. in vivo l’infezione è un approccio rigoroso per valutare la virulenza del parassita, ma misure lesione basate su grassatore gonfiore da solo sono spesso inadeguate, come essi riflettono la risposta infiammatoria nei tessuti infetti e non il numero assoluto di parassiti. Per questo motivo, lo sviluppo della lesione grassatore saggi devono essere seguite da quantificazione del carico parassita nei tessuti infetti, una procedura che richiede diluizione limitante lunghi saggi28. Inoltre, in vivo gli studi coinvolgono spesso sacrificare animali multipli in diversi punti nel tempo per estrarre tessuti di interesse6,8,9,10, 11 , 13. al contrario, grandi numeri di saggi possono essere ottenuti da un solo animale, e queste cellule possono essere placcate in condizioni tali da consentono la valutazione dell’infezione in vari punti nel tempo. Inoltre, rispetto agli studi in vivo , in vitro infezioni BMM l’esecuzione consente maggiore controllo sulle condizioni sperimentali. Quantificare i macrofagi infetti con i parassiti stessi consente un controllo preciso della molteplicità di infezione (MOI) e di condizioni di coltura. Controllo preciso su questi fattori può essere chiave nell’identificare le caratteristiche delle vie cellulari discrete e nella comprensione del loro impatto sul corso dell’infezione.
Dato questi vantaggi, è un po’ sorprendente che molto pochi gruppi studiando Leishmania virulenza finora hanno preso pieno vantaggio della valutazione quantitativa di replica intracellulare in macrofagi. In questo articolo, discutiamo i problemi comuni che possono ostacolare l’utilizzazione più ampia di questo test e fornire un protocollo dettagliato per facilitare la corretta esecuzione. Considerando la sua precisione e versatilità, il BMM infezione analisi che descriviamo qui può non solo essere utilizzata per esplorare le interazioni ospite-patogeno che influenzano la virulenza di Leishmania , ma anche di studiare altri microrganismi che replicano all’interno macrofagi29. D’importanza, questo test può essere sviluppato anche come metodo di screening pre-clinico rapido ed economico per lo sviluppo di farmaci anti-leishmanial.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dati quantitativi di prodotto da BMM infezione dosaggio descritto in precedenza, consente ai ricercatori di ottenere tassi di infezione e una determinazione affidabile delle modifiche nelle proprietà di virulenza in un relativamente breve periodo di tempo (massimo 2 settimane, rispetto al 2 mesi previsti per gli esperimenti in vivo ). Questo metodo si basa sul colorante specifico DNA DAPI, che in particolare i nuclei del macrofago e parassita di macchie e permette la rapida identificazione e quantificazione d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute RO1 AI067979 a NWA.
YK è destinatario della borsa di studio dello studente non laureato da Howard Hughes Medical Institute/Università di Maryland College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
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