Een Model van de ligaturen intestinale lus in narcose van specifieke pathogenen vrije kippen te bestuderen van Clostridium Perfringens virulentie
Summary
Hier presenteren we een protocol om te ‘intestinale ligaturen loops’ in kip dunne darmen operatief te maken. Deze procedure kan voor het vergelijken van meerdere Clostridium perfringens stammen virulentie in situ in één host. Deze methode vermindert aanzienlijk het aantal kippen meestal nodig voor soortgelijke in vivo experimenten.
Abstract
Necrotische enteritis werd bestudeerd bij kippen met behulp van verschillende in vivo infectie modellen. Een combinatie van predisponerende factoren zoals coccidiosis en voeding, de meeste van deze gebruiken met maagsonde of administratie via de feed met behulp van Clostridium perfringens. In deze modellen vereist de vergelijking van meerdere C. perfringens stammen voor virulentie studies een groot aantal hosts om significante resultaten te verkrijgen. Sterfte in de loop van de studie kunnen hoge afhankelijk van het experimentele model, vandaar de ethische bezorgdheid met betrekking tot het welzijn van dieren in het onderzoek. De ontwikkeling van nieuwe modellen van de infectie waarbij minder dieren te bestuderen pathogenese, nog het verkrijgen van statistisch significante en geldige resultaten, is belangrijk bij het terugdringen van dierlijke gebruik in onderzoek. Intestinale ligaturen lus modellen zijn gebruikt om de studie van clostridial infecties in verschillende soorten zoals muizen, konijnen en kalveren. Na chirurgische ingrepen om ligaturen lus segmenten te maken, C. perfringens stammen worden geïnjecteerd rechtstreeks in de lussen om een nauw contact tussen de bacteriën en de intestinale mucosa. Monsters van de dunne darm en luminal inhoud worden genomen bij de beëindiging van de procedures na een paar uur. Meerdere bacteriestammen kunnen worden geënt in elk dier, dus vermindering van het aantal vereiste onderwerpen in de experimenten. Ook de procedures worden uitgevoerd onder algehele narcose om dieren pijn te verminderen. Bij kippen zou dit model meer aangewezen dan orale toediening te vergelijken C. perfringens stam pathogeniteit omdat minder dieren nodig zijn, geen predisponerende factoren nodig zijn voor het opwekken van de ziekte en pijn wordt gecontroleerd door pijnstillers . Het model van de intestinale ligaturen lus is slecht beschreven is bij kippen en standaardisatie is essentieel voor het optimale gebruik ervan. Dit manuscript biedt alle nodige stappen om de talrijke intestinale ligaturen loops maken in kippen en brengt informatie van de kritieke punten om geldige resultaten te verkrijgen.
Introduction
Het gebruik van dierlijke modellen om te studeren van besmettelijke ziekten bij mens en dier is een centraal instrument bij de beoordeling van virulentiefactoren regulering van de pathogenese van een bepaalde voorwaarde evenals aan het uitwerken van strategieën om te voorkomen of genezen van ziekten1. Ondanks de talrijke voordelen van het gebruik van dierlijke modellen om te studeren van diverse ziekten, ontstaan ethische bezwaren met betrekking tot deze praktijk. Onderzoekers moeten tot een minimum beperken dierlijke terwijl het verkrijgen van aanzienlijke en geldig resultaten. Het concept van de 3 Rs-beginselen (vervangen, verminderen en verfijnen) werd uitgewerkt om ervoor te zorgen dat sociale kwesties werden behandeld in dergelijke proeven. Kip necrotische enteritis studies, worden in vivo kip modellen gebruikt om te onderzoeken de etiologie, preventie en behandelingen van deze voorwaarde2,3,4,5. Pathogene stammen van C. perfringens uitvoering van specifieke virulentiefactoren, zoals de NetB toxine6, worden beheerd om het necrotische enteritis veroorzaken in kippen7. Het beginsel van vervanging is daarom moeilijk te bereiken in een dergelijk geval ook deze virulentiefactoren niet als kritiek op andere diersoorten mogen. De meeste modellen voor necrotische enteritis in kippen gebruik een combinatie van risicofactoren, zoals coccidiosis en veranderd dieet om te induceren necrotische enteritis gevolgd door middel van een maagsonde voor bouillon cultuur met grote aantallen C. perfringens2. Deze modellen zullen het opwekken van de ziekte in een groot aantal kippen kan, en sterfte belangrijk zijn in dergelijke proeven8, dus bezorgdheid over de vermindering en verfijning principes in het dierlijke onderzoek.
Intestinale ligaturen lussen modellen zijn een wenselijk alternatief voor de studie van ziekten veroorzaakt door intestinale ziekteverwekkers met betrekking tot het beginsel vermindering en verfijning. In deze modellen, worden intestinale segmenten genaamd ‘lussen’ gemaakt door het plaatsen van ligaturen langs het darmkanaal vormen van onafhankelijke en hermetische compartimenten waar ziekteverwekkers kunnen worden geïnjecteerd alleen9 of met andere moleculen, zoals vaccin kandidaten 10 , 11. de ziekteverwekkers van belang staan in nauw contact met de intestinale cellen en na een paar uur tijd van infectie, intestinale monsters kunnen worden teruggekregen voor verdere analyse. Hierdoor kan het gebruik van meerdere behandeling en controlegroepen in hetzelfde dier. Statistische analyse kan met herhaalde maatregelen modellen, die verhoogt de macht van de discriminatie tussen groepen en vermindert het aantal nodige kippen in vergelijking met mondelinge maagsonde proeven worden uitgevoerd. Ook worden chirurgische ingrepen en latere infectie tijden uitgevoerd onder continue narcose en Analgesie, dus het minimaliseren van de dierlijke pijn. Kringloop ligations zijn een ideale sjabloon voor vermindering van de nummers van de host en het creëren van een meer humane systeem in dierlijke onderzoek.
Intestinale ligaturen lussen modellen zijn ook beschreven in verschillende soorten, zoals kalveren, konijnen en muizen2,9, maar slecht in kippen7beschreven. Voor een optimaal gebruik van deze chirurgische model, zijn de juiste techniek en uitvoering zijn essentieel voor het creëren van ligaturen intestinale lussen om te voorkomen dat schade aan de intestinale integriteit. Het doel van dit manuscript is voor het beschrijven van een stap voor stap methode bij het creëren van meerdere intestinale lussen in een kip-model. Deze techniek wordt beperkt door de surgeon’s vaardigheid en ervaring, zoals nauwkeurige procedures essentieel voor het succes van het project zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intestinale lussen modellen zijn beschreven in vele soorten te bestuderen van host-pathogen interactions en pathogenese van ziekten veroorzaakt door verschillende intestinale ziekteverwekkers, zoals Clostridium perfringens, Clostridium difficile en Salmonella enterica7,9,13,14,15. Het is ook gebruikt voor het analyseren van de mucosa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de stoel in pluimvee onderzoek (M. Boulianne) van de Faculteit Diergeneeskunde van de Université de Montréal. Drs. Boulianne en bovenliggende ontwikkelde het model. Drs. Boulianne en bovenliggende uitgevoerd de operaties. Dr. Burns bijgestaan bij de ontwikkeling van het protocol van de verdoving. Dr. Parent de video bewerkt en schreef het manuscript. Drs Burns, Desrochers en Boulianne bewerkt het manuscript.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
References
- Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
- Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
- Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
- Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
- Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
- Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26 (2008).
- Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
- Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
- Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
- Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52 (2016).
- Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101 (2016).
- Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
- Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608 (2012).
- Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
- Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5 (2009).
- Gerdts, V., et al. Multiple intestinal ‘loops’ provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
- Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
- Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
- Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
- Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).
