Un modelo de asa Intestinal ligados en pollos libre anestesiados patógenos específicos para el estudio de virulencia de Clostridium Perfringens
Summary
Aquí presentamos un protocolo quirúrgico crear «loops ligados intestinales» en intestino de pollo. Este procedimiento permite la comparación de virulencia en situ en un único host de varias cepas de Clostridium perfringens . Este método disminuye marcadamente el número de pollos generalmente necesarios para experimentos similares en vivo .
Abstract
Enteritis necrótica fue estudiada en pollos utilizando varios en vivo modelos de infección. La mayoría de éstos utiliza una combinación de factores predisponentes, tales como coccidiosis y dieta, con sonda nasogástrica o administración a través de la alimentación usando Clostridium perfringens. En estos modelos, la comparación de múltiples cepas de C. perfringens para estudios de virulencia requiere un gran número de hosts para obtener resultados significativos. Durante el curso del estudio de la mortalidad puede ser alta dependiendo del modelo experimental, por lo tanto, levantando preocupaciones éticas sobre el bienestar de los animales en la investigación. El desarrollo de nuevos modelos de infección que requieran menos animales para estudiar la patogenesia, pero proporciona resultados válidos y estadísticamente significativos, es importante en la reducción del uso de animales en investigación. Modelos de asa intestinal ligados se han utilizado para estudiar las infecciones clostridiales en diversas especies como ratones, conejos y terneros. Después de procedimientos quirúrgicos para crear segmentos ligados lazo, cepas de C. perfringens se inyectan directamente en los lazos para establecer un contacto cercano entre las bacterias y la mucosa intestinal. Se toman muestras de intestino delgado y contenido luminal en la terminación de los procedimientos después de unas horas. Múltiples cepas bacterianas pueden ser inoculadas en cada animal, por lo tanto reduciendo el número de sujetos necesarios en los experimentos. También, los procedimientos se realizan bajo anestesia general para reducir el dolor animal. En los pollos, este modelo sería más adecuado que la administración oral para comparar la patogenicidad de C. perfringens cepa porque se necesitan menos animales, factores predisponentes no deben inducir a la enfermedad y dolor se controla con analgésicos . El modelo de asa intestinal ligados está pobremente descrito en pollos y estandarización es esencial para su uso óptimo. Este manuscrito ofrece todos los pasos necesarios para crear numerosos bucles ligados intestinales en pollos y aporta información sobre los puntos críticos para obtener resultados válidos.
Introduction
El uso de modelos animales para estudiar enfermedades infecciosas que afectan a los seres humanos y animales es una herramienta central en la evaluación de factores de virulencia, regulación de la patogenia de una enfermedad específica, así como a elaborar estrategias para prevenir o curar enfermedades1. A pesar de numerosas ventajas de la utilización de modelos animales para estudiar diversas enfermedades, han surgido preocupaciones éticas con respecto a esta práctica. Los investigadores deben minimizar el uso de animales y obtención de resultados significativos y válidos. El concepto de los 3 principios de Rs (reemplazar, reducir y refinar) fue elaborado para asegurar que en dichos estudios se abordaron temas de bienestar. En estudios de NE de pollo, en vivo pollo modelos se utilizan para investigar la etiología, prevención y tratamientos de esta condición2,3,4,5. Las cepas patógenas de C. perfringens que llevan factores de virulencia específicos, tales como la RedB toxina6, son administradas para causar enteritis necrótica en pollos7. Por lo tanto, el principio de sustitución es difícil de lograr en este caso como estos factores de virulencia pueden no ser tan críticos en otras especies animales. Mayoría de los modelos de enteritis necrótica en los pollos utiliza una combinación de factores de riesgo, tales como coccidiosis y alterado dieta para inducir enteritis necrótica seguida por sonda nasogástrica del caldo de cultivo que contienen grandes cantidades de C. perfringens2. Estos modelos inducirán la enfermedad en un gran número de pollos, y la mortalidad puede ser importante en estos ensayos8, así levantando preocupaciones acerca de los principios de reducción y refinamiento en la investigación animal.
Modelos de lazos ligados intestinal son una alternativa deseable para el estudio de enfermedades inducidas por patógenos intestinales en relación con el principio de reducción y refinamiento. En estos modelos, se crean segmentos de intestino llamados ‘loops’ mediante la colocación de ligaduras a lo largo del tracto intestinal para formar compartimentos independientes y herméticos donde patógenos pueden inyectar solo9 o con otras moléculas, tales como candidatos vacunales 10 , 11. los patógenos de interés estén en estrecho contacto con las células intestinales y que después de algunas horas de tiempo de infección, las muestras intestinales pueden ser recuperadas para su posterior análisis. Esto permite el uso de múltiples grupos de control y tratamiento en el mismo animal. Análisis estadístico puede realizarse con modelos de medidas repetidas, que aumenta el poder de discriminación entre grupos y reduce el número de gallinas necesarios en comparación con los ensayos orales gavage. También, procedimientos quirúrgicos y los tiempos de infección subsecuente se realizan bajo anestesia general continua y analgesia, por lo tanto, reducir al mínimo el dolor animal. Trompas de lazo cerrado están una plantilla ideal para reducir el número de host y crear un sistema más humano en la investigación animal.
Modelos de lazos ligados intestinal son bien descritos en varias especies, tales como terneros, conejos y ratones2,9, pero mal descritos en pollos7. Para un uso óptimo de este modelo quirúrgico, ejecución y la técnica adecuada son esenciales para la creación de bucles intestinales ligados para evitar daños a la integridad intestinal. El objetivo de este manuscrito es describir un método paso a paso en la creación de múltiples asas intestinales en un modelo de pollo. Esta técnica está limitada por la habilidad del cirujano y la experiencia, como procedimientos precisos son esenciales para el éxito del proyecto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos de asas intestinales se han descrito en numerosas especies para estudiar la interacción huésped-patógeno y patogenia de las enfermedades causadas por varios patógenos intestinales, como Clostridium perfringens, Clostridium difficile y Enterica de las salmonelas7,9,13,14,15. También se ha utilizado para analizar la respue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Cátedra de investigación de aves de corral (M. Boulianne) de la Facultad de medicina veterinaria de la Université de Montréal. Padres y los doctores Boulianne desarrollaron el modelo. Drs. Boulianne y padres realizaron las cirugías. El Dr. Burns ayudó a desarrollar el protocolo de anestesia. Dr. Parent había editado el video y escribió el manuscrito. DRS de Burns, Desrochers y Boulianne editan el manuscrito.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
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