Ein Modell der aufgespaltenen Dünndarmschlinge in Kostenlose Hühner narkotisierten spezifischen Erreger Clostridium Perfringens Virulenz zu studieren
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um chirurgisch “Darm aufgespaltenen Loops” Huhn Dünndarm schaffen. Dieses Verfahren ermöglicht den Vergleich von mehreren Clostridium Perfringens Stämmen Virulenz in Situ in einem einzelnen Host. Diese Methode verringert deutlich die Anzahl der Hühner in der Regel für ähnliche in Vivo Experimente notwendig.
Abstract
Nekrotische Enteritis wurde bei Hühnern, die mit verschiedenen in Vivo Infektionsmodelle untersucht. Die meisten davon verwenden eine Kombination der prädisponierenden Faktoren wie Kokzidiose und Ernährung, mit Magensonde oder Verabreichung über das Futter mit Clostridium Perfringens. In diesen Modellen erfordert der Vergleich mehrerer C. Perfringens Belastungen für Virulenz Studien eine große Anzahl von Hosts, signifikante Ergebnisse zu erhalten. Sterblichkeit im Verlauf der Studie kann je nach experimentellen Modell, daher ethische Bedenken bezüglich Tierschutz in der Forschung hoch sein. Die Entwicklung der neuen Infektionsmodelle erfordern weniger Tiere, Pathogenese, noch eine statistisch signifikante und gültige Ergebnisse zu studieren ist wichtig bei der Verringerung der Tierversuche in der Forschung. Aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modelle wurden verwendet, um eine Infektionen in verschiedenen Arten wie Mäuse, Kaninchen und Kälber zu studieren. Nach chirurgischen Eingriffen, aufgespaltenen Schleife Segmente zu erstellen sind C. Perfringens Stämmen direkt in die Schlaufen herstellen einen engen Kontakt zwischen den Bakterien und die Darmschleimhaut injiziert. Proben der Dünndarm und der luminalen Inhalte sind bei Beendigung der Verfahren nach ein paar Stunden genommen. In jedem Tier, damit die Verringerung der Anzahl der erforderlichen Themen in den Experimenten können mehrere Bakterienstämme inokuliert werden. Auch sind Eingriffe unter Vollnarkose, Tieren Schmerzen zu reduzieren. Bei Hühnern wäre dieses Modell besser geeignet als orale Verabreichung, C. Perfringens Belastungen Pathogenität zu vergleichen, weil weniger Tiere erforderlich sind, keine prädisponierenden Faktoren erforderlich sind, um die Krankheit zu induzieren und Schmerz durch Analgetika gesteuert wird . Die aufgespaltenen Dünndarmschlinge Modell ist schlecht beschrieben bei Hühnern und Standardisierung ist wichtig für die optimale Nutzung. Diese Handschrift enthält die notwendigen Schritte um zahlreiche Darm aufgespaltenen Schleifen bei Hühnern zu erstellen und bringt Informationen über die kritischen Punkte um valide Ergebnisse zu erhalten.
Introduction
Die Verwendung von Tiermodellen, ansteckende Krankheiten, die Auswirkungen auf Mensch und Tier zu studieren ist ein zentrales Instrument bei der Beurteilung der Virulenzfaktoren Regulierung der Pathogenese einer bestimmten Bedingung sowie, erarbeiten Strategien zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten1. Trotz der zahlreichen Vorteile der Verwendung von Tiermodellen um zu verschiedenen Krankheiten zu studieren entstehen ethische Bedenken in Bezug auf diese Praxis. Forscher müssen Verwendung von Tieren bei der Erlangung relevanter und gültige Ergebnisse zu minimieren. Das Konzept der 3 Rs Grundsätze (Replace, Reduce und verfeinern) wurde erarbeitet, um sicherzustellen, dass Tierschutz in solchen Studien behandelt wurden. In Huhn nekrotische Enteritis Studien sind in Vivo Huhn Modelle zur Ätiologie, Verhütung und Behandlung von diesem Zustand2,3,4,5zu untersuchen. Pathogene Stämme von C. Perfringens tragen spezielle Virulenzfaktoren, wie z. B. der NetB Toxin6, werden verabreicht, um nekrotische Enteritis in Hühner7verursachen. Das Ersatz-Prinzip ist daher schwierig, in einem solchen Fall zu erreichen, da diese Virulenzfaktoren möglicherweise nicht so kritisch bei anderen Tierarten. Die meisten Modelle für nekrotische Enteritis bei Hühnern verwenden eine Kombination von Risikofaktoren wie Kokzidiose und veränderte Ernährung zu induzieren nekrotische Enteritis, gefolgt von Magensonde bouillonkultur mit einer großen Anzahl von C. Perfringens2. Diese Modelle werden die Krankheit in eine große Anzahl von Hühnern induzieren und Sterblichkeit kann in solchen Studien8, so Bedenken über die Reduzierung und Raffinesse Prinzipien in Tierversuchen wichtig sein.
Intestinale aufgespaltenen Schleifen Modelle sind eine wünschenswerte Alternative für das Studium der Krankheiten ausgelöst durch Darm Krankheitserreger in Bezug auf die Reduzierung der Grundsatz und Raffinesse. In diesen Modellen entstehen indem man Ligaturen, entlang den Darm-Trakt, unabhängige und hermetische Fächer zu bilden, wo Krankheitserreger allein9 injiziert werden können, oder mit anderen Molekülen, wie z. B. Impfstoffkandidaten Darm Segmente, so genannte “Loops” 10 , 11. die Erreger von Interesse stehen in engem Kontakt mit der Darmzellen und nach ein paar Stunden hinweg Infektion, intestinale Proben zur weiteren Analyse gewonnen werden können. Dies ermöglicht die Verwendung von mehreren Behandlungs- und Kontrollgruppen im selben Tier. Statistische Analyse kann mit Messwiederholungen Modelle, die die Kraft der Unterscheidung zwischen Gruppen erhöht und reduziert die Anzahl der notwendigen Hühner im Vergleich zu oralen Magensonde Studien durchgeführt werden. Darüber hinaus sind chirurgische Eingriffe und anschließende Infekt-Zeiten unter kontinuierlicher allgemeine Anästhesie und Analgesie, damit den Tieren Schmerzen zu minimieren durchgeführt. Closed-Loop-grundsätzlich sind eine ideale Vorlage zur Verringerung der Host-Nummern und eine menschlichere System in Tierversuchen zu schaffen.
Intestinale aufgespaltenen Schleifen Modelle sind gut beschrieben in verschiedenen Arten, wie Kälber, Hasen und Mäuse2,9, aber schlecht in Hühner7beschrieben. Für eine optimale Nutzung dieses chirurgische Modells sind richtige Technik und Ausführung Voraussetzung für die Schaffung der aufgespaltenen Darm Schleifen zur Vermeidung von Schäden für die intestinale Integrität. Das Ziel dieser Handschrift ist eine Schritt-für-Schritt-Methode bei der Schaffung von mehreren Darm Schleifen in einem Huhn-Modell zu beschreiben. Diese Technik ist durch Geschick und Erfahrung des Operateurs begrenzt, da genaue Verfahren essentiell für den Erfolg des Projekts sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intestinale Schleifen Modelle wurden in zahlreichen Arten, Wirt-Pathogen Interaktionen und Pathogenese von Krankheiten, die durch verschiedene Darm Krankheitserreger, wie , Clostridium Perfringensund Clostridium Difficile zu studieren beschrieben Salmonella Enterica7,9,13,14,15. Es wurde auch verwendet, der mukosalen Immunantwort<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Lehrstuhl für Geflügel Forschung (M. Boulianne) von der Veterinär-medizinische Fakultät der Université de Montréal unterstützt. DRS. Boulianne und Eltern entwickelt das Modell. DRS. Boulianne und Eltern durchgeführt die Operationen. Dr. Burns unterstützt bei der Entwicklung der Anästhesie-Protokoll. Dr. Parent das Video bearbeitet und schrieb das Manuskript. DRS-Burns, Desrochers und Boulianne bearbeitet das Manuskript.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
References
- Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
- Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
- Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
- Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
- Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
- Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26 (2008).
- Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
- Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
- Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
- Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52 (2016).
- Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101 (2016).
- Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
- Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608 (2012).
- Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
- Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5 (2009).
- Gerdts, V., et al. Multiple intestinal ‘loops’ provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
- Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
- Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
- Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
- Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).
