Un modello di ciclo intestinale legati nei polli gratis anestetizzati patogeno specifico per studiare la virulenza di Clostridium Perfringens
Summary
Qui presentiamo un protocollo per creare chirurgicamente ‘anse intestinali legati’ in intestini di pollo. Questa procedura consente il confronto di virulenza in situ in un singolo host di più ceppi Clostridium perfringens . Questo metodo notevolmente riduce il numero di polli solitamente necessari per simili esperimenti in vivo .
Abstract
Enterite necrotica è stata studiata in polli utilizzando vari modelli in vivo di infezione. La maggior parte di questi utilizzano una combinazione di fattori predisponenti, quali la coccidiosi e dieta, con sonda gastrica o amministrazione tramite il feed utilizzando Clostridium perfringens. In questi modelli, il confronto di più ceppi di c. perfringens per studi di virulenza richiede un numero elevato di host per ottenere risultati significativi. Mortalità durante il corso dello studio può essere elevato a seconda del modello sperimentale, quindi sollevare preoccupazioni di ordine etico per quanto riguarda il benessere degli animali nella ricerca. Lo sviluppo di nuovi modelli di infezione che richiedono meno animali per studiare la patogenesi, ancora fornire risultati statisticamente significativi e validi, è importante nella riduzione dell’uso di animali nella ricerca. Ciclo intestinale dei modelli sono stati utilizzati per studiare le infezioni clostridiali in varie specie come topi, conigli e vitelli. A seguito di interventi chirurgici per creare loop dei segmenti, ceppi di c. perfringens vengono iniettati direttamente i loop per stabilire uno stretto contatto tra i batteri e la mucosa intestinale. Al termine delle procedure dopo poche ore vengono prelevati campioni dell’intestino tenue e del contenuto luminale. Ceppi batterici multipli possono essere inoculati in ogni animale, quindi riducendo il numero di materie richieste negli esperimenti. Inoltre, le procedure vengono eseguite in anestesia generale per ridurre il dolore animale. Nei polli, questo modello sarebbe più appropriato che la somministrazione orale di confrontare la patogenicità del ceppo di c. perfringens perché meno animali sono necessari, fattori predisponenti non sono necessaria per indurre la malattia e dolore è controllato da analgesici . Il modello di ciclo intestinale legato è descritto male nei polli e standardizzazione è essenziale per il suo utilizzo ottima. Questo manoscritto fornisce tutti i passaggi necessari per creare numerose anse intestinali legati nei polli e porta informazioni sui punti critici per ottenere risultati validi.
Introduction
L’uso di modelli animali per studiare le malattie infettive che colpiscono gli esseri umani e animali è uno strumento centrale nella valutazione di fattori di virulenza che regolano la patogenesi di una condizione specifica anche quanto a elaborare strategie per prevenire o curare malattie1. Nonostante i numerosi vantaggi dell’utilizzo di modelli animali per lo studio di varie malattie, stanno sorgendo preoccupazioni etiche per quanto riguarda questa pratica. I ricercatori hanno bisogno per ridurre al minimo l’uso di animali mentre ottenendo risultati significativi e validi. Il concetto dei 3 principi Rs (sostituire, ridurre e raffinare) è stato elaborato per assicurare che a tali prove sono state affrontate questioni di benessere. Negli studi di enterite necrotica del pollo, in vivo modelli di pollo sono utilizzati per indagare l’eziologia, prevenzione e trattamenti di questa condizione2,3,4,5. Ceppi patogeni di c. perfringens che trasportano fattori di virulenza specifici, ad esempio la tossina ReteB6, sono somministrati per causare enterite necrotica in polli7. Il principio di sostituzione è, pertanto, difficile da raggiungere in tal caso come questi fattori di virulenza non possono essere come critici in altre specie animali. Maggior parte dei modelli per l’enterite necrotica nei polli utilizzare una combinazione di fattori di rischio, quali la coccidiosi e alterato dieta per indurre l’enterite necrotica seguita mediante sonda gastrica del brodo di coltura contenenti un elevato numero di c. perfringens2. Questi modelli potranno indurre la malattia in un gran numero di polli, e la mortalità può essere importante in tali prove8, così sollevando preoccupazioni circa i principi di riduzione e raffinatezza nella ricerca animale.
Anse intestinali dei modelli sono un’alternativa desiderabile per lo studio delle malattie indotte da patogeni intestinali per quanto riguarda la riduzione di principio e la raffinatezza. In questi modelli, vengono creati segmenti intestinali chiamati ‘loop’ inserendo le legature lungo il tratto intestinale per formare compartimenti indipendenti ed ermetici dove gli agenti patogeni possono essere iniettati solo9 o con altre molecole, quali vaccini candidati 10 , 11. gli agenti patogeni di interesse si trovano a stretto contatto con le cellule intestinali e dopo poche ore di tempo di infezione, campioni intestinali possono essere recuperati per ulteriori analisi. Questo consente l’utilizzo di più gruppi di controllo e di trattamento dello stesso animale. Analisi statistica può essere eseguita con modelli di misure ripetute, che aumenta il potere di discriminazione tra gruppi e riduce il numero di polli necessarie rispetto alle prove di alimentazione mediante sonda gastrica orale. Inoltre, le procedure chirurgiche e tempi di infezione successiva vengono eseguite sotto anestesia generale continua e analgesia, quindi riducendo al minimo il dolore animale. Anello chiuso legature sono un modello ideale per ridurre il numero di host e creare un sistema più umano nella ricerca animale.
Anse intestinali dei modelli sono ben descritti in varie specie, come vitelli, conigli e topi2,9, ma scarsamente descritto in polli7. Per un uso ottimale di questo modello chirurgico, l’esecuzione e la tecnica adeguata sono essenziali per la creazione delle anse intestinali legati per evitare danni all’integrità intestinale. L’obiettivo di questo manoscritto è di descrivere un metodo passo passo nella creazione delle anse intestinali multiple in un modello di pollo. Questa tecnica è limitata dalla abilità del chirurgo e dall’esperienza, come procedure esatte sono essenziali per il successo del progetto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelli di anse intestinali sono stati descritti in numerose specie per studiare l’interazione ospite-patogeno e la patogenesi di malattie causate da vari agenti patogeni intestinali, quali Clostridium perfringens, Clostridium difficile e Salmonella enterica7,9,13,14,15. È stato utilizzato anche per analizzare la risposta immunitari…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta dal Presidente nella ricerca di pollame (Boulianne M.) dalla facoltà di medicina veterinaria di Université de Montréal. D. ssa Boulianne e padre ha sviluppato il modello. D. ssa Boulianne e padre effettuati gli interventi chirurgici. Dottor Burns ha aiutato nello sviluppo del protocollo di anestesia. Dr. Parent modificato il video e ha scritto il manoscritto. DRS Burns, Desrochers e Boulianne modificato il manoscritto.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
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