Laser Capture Microdissection von hochreinen trabekuläre Geflecht aus Maus Augen für Gene Expression Analysis
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine reproduzierbare Laser Capture Microdissection (LCM) zur Isolierung von trabekuläre Geflecht (TM) für die nachgelagerten RNA-Analyse. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Genexpression im TM zu analysieren hilft beim Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der TM-okulären Erkrankungen.
Abstract
Laser Capture Microdissection (LCM) hat erlaubt Gen Ausdruck Analyse einzelner Zellen und Zell-Populationen in Gewebeschnitten bereichert. LCM ist ein großes Werkzeug für die Erforschung der molekularen Mechanismen, die Zelldifferenzierung und der Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten, einschließlich Glaukom. Glaukom, umfasst eine Familie von progressive optic Neuropathien, ist die häufigste Ursache von irreversible Blindheit weltweit. Strukturelle Veränderungen und Schäden innerhalb der trabekuläre Geflecht (TM) führt zu erhöhter Augeninnendruck (IOP), ist ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Glaukom. Die genauen molekularen Mechanismen sind jedoch noch kaum erforscht. Die Fähigkeit zur Genanalyse Ausdruck wird bei der Beschaffung weitere Einblicke in die Funktion dieser Zellen und ihre Rolle bei der Regulation des IOP und Glaukom Entwicklung entscheidend sein. Um dies zu erreichen, eine reproduzierbare Methode zur Isolierung von hoch angereichert TM von Gefrierschnitte Maus Augen und eine Methode für nachgeschaltete Gen Expressionsanalyse, wie RT-qPCR und RNA-Seq ist erforderlich. Die hier beschriebene Methode wurde entwickelt, um hochreines TM von Maus Augen für nachgeschaltete digitale PCR und Microarray Analyse isolieren. Darüber hinaus kann diese Technik für die Isolierung von anderen hoch angereicherten okuläre Zellen und Zelle Kompartimente, die schwer zu isolieren von Maus Augen wurden leicht angepasst werden. Die Kombination von LCM und RNA Analyse kann auf ein umfassenderes Verständnis der zellulären Ereignisse zugrunde liegenden Glaukom beitragen.
Introduction
Das Glaukom ist eine Gruppe von Krankheiten, die durch optische Neuropathie und Retinopathie, die letztlich zu irreversibler Blindheit1,2gekennzeichnet. Es wird geschätzt, dass bis 2020 mehr als 70 Millionen Menschen weltweit mit irgendeiner Form der Krankheit3,4,5,6,7Leben werden werden. Primären Offenwinkelglaukom (POAG), die häufigste Form des Glaukoms, zeichnet sich durch eine Abnahme der Kammerwasser (AH) Abfluss führt zu erhöhter Augeninnendruck (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Linke unbehandelte, chronisch erhöhten Augendruck führt zur progressiven und irreversible Schäden an der Netzhaut und Sehnerv Kopf verursacht radial Blindheit1,2,19. Alle aktuellen Methoden zur Verlangsamung des Fortschreitens der Glaukom-Fokus auf die Verringerung der IOP, entweder durch Verringerung der Rate der Produktion von AH durch den ziliarkörper oder Verbesserung seiner Abfluss1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. die trabekuläre Geflecht (TM) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der primären AH Abfluss Weg aktiv und seine falsche Funktion ist ein auslösender Faktor für Hypertensive Glaukom1,2,19. Jedoch die molekularen Mechanismen, die TM Dysfunktion und wie sie AH Entwässerung regelt zugeordnet sind noch nicht vollständig geklärt und ist derzeit ein Schwerpunkt von Glaukom Forschung1,2,19, 20. während mehrere genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) eine Reihe von Genen Glaukom und erhöhte Resistenz gegen AH-Abfluss-Anlage in der TM verbunden haben, die genauen molekularen Mechanismen, die zu Krankheit führen, sind nicht noch vollständig verstanden21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Tiermodelle haben unseren derzeitigen Kenntnissen des Fortschreitens der Krankheit bei Glaukom (ausführlich rezensiert in3,15,16,26,27,28, stark verbessert. 29,30,31,32,33). Einige bahnbrechende Methoden wurden entwickelt, um die TM34,35,36 zu studieren und diese Methoden häufig verwendet wurden, um unser gegenwärtiges Verständnis der normalen und krankem Gewebe fördern. Ein Bereich, der nicht ausgiebig erforscht worden ist, ist die Verwendung von gentechnisch veränderte Mausmodelle, die molekularen Mechanismen der TM Scheitern zu studieren. Transgene Knock-in und Knock-out-Maus-Studien von TM verbundenen Gene, wie Myocilin (Myoc)37,38 und Cyp1b139, wurden die wichtigsten Tools für die Erforschung der molekularen Mechanismen der TM Funktion. Verständlicherweise, stellt die geringe Größe der TM bei Mäusen eine schwere Hürde, die überwunden werden muss, um zu beginnen, dieses Gewebe zu studieren. Maus-Modellen sind ein mächtiges Werkzeug für die Erforschung der Genetik und molekulare Mechanismen der Krankheit, während Fortschritte in der LCM Technologien die notwendigen Werkzeuge liefern, um die Studie der kleinste und zarteste Gewebe, einschließlich der TM zu befähigen.
In diesem Bericht wird eine stabile und reproduzierbare Methode für die LCM von hochangereichertem TM von Maus Augen zusammen mit nachfolgenden RNA Isolation und Verstärkung für nachgeschaltete Expressionsanalyse beschrieben. Ähnliche Methoden wurden verwendet, erfolgreich bei Mäusen um andere Arten von Auge Gewebe40,41,42,43,44zu isolieren, die hierin berichtet Methodik kann auf andere diskrete Gewebe des Auges, RNA, DNA, RNA und Proteine zu studieren. Wichtig ist, ermöglicht diese Technik den Einsatz von genetisch veränderten Mäusen zum besseren Verständnis die molekularen Pathogenese der TM Beeinträchtigung bei Glaukom und okuläre Erkrankung3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Die Fähigkeit, die TM der Maus Eyes von LCM isolieren wird eine nützliche Technik bei der Beschaffung weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen der verschiedenen okulären Erkrankungen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die TM spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der homöostatischen IOP aktiv und seiner Dysfunktion ist weithin anerkannt als des wichtigsten ursächlichen Faktors für Hypertensive Glaukom1,2,19. Eine Reihe von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen in mehreren Genen GWAS Analyse festgestellten sind mit erhöhten Glaukom-Risiko und erhöhte Resistenz gegen AH-Abfluss-Anlage in der TM verbunden worden; Allerdings sin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
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