JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

לייזר Microdissection לכידה של מאוד טהור Meshwork Trabecular מעיני העכבר עבור ניתוח ביטוי גנטי

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57576
, , , , , , ,
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור microdissection לכידה לייזר לשחזור (LCM) לבידוד meshwork trabecular (TM) לניתוח RNA במורד הזרם. היכולת לנתח שינויים בביטוי הגנים ב ה-TM יעזור להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של מחלות עינית הקשורות TM.

Abstract

לייזר לכידת microdissection (LCM) מותר ניתוח ביטוי גנטי של תאים בודדים, מועשר תא אוכלוסיות בסעיפים רקמות. LCM הוא כלי נהדר עבור חקר המנגנונים המולקולריים שבבסיס תאית התמיינות ואת פיתוח ההתקדמות של מחלות שונות, כולל גלאוקומה. גלאוקומה, אשר כוללת משפחה של מחלות עצבים אופטית מתקדמת, היא הסיבה השכיחה ביותר לעיוורון בלתי הפיך ברחבי העולם. שינויים מבניים ונזק בתוך meshwork trabecular (TM) יכול לגרום לחץ תוך-עיני מוגבר (IOP), המהווה גורם סיכון עיקרי לפתח גלאוקומה. עם זאת, המנגנון המולקולרי מדויק מעורבים הם הבינו עדיין כהלכה. היכולת לבצע ניתוח ביטוי גנטי תהיה מכרעת בהשגת עוד תובנות הפונקציה של תאים אלה ותפקידו בוויסות IOP ופיתוח גלאוקומה. כדי להשיג זאת, שיטה ישימה עבור בידוד גבוהה מועשר TM ממקטעים קפוא של העכבר ואת שיטת ניתוח ביטוי גנטי במורד הזרם, כגון RT-qPCR ו- RNA-Seq נדרש. השיטה המתוארת במסמך זה מפותח כדי לבודד TM מאוד טהור עיניים העכבר PCR דיגיטלי במורד הזרם וניתוח microarray. בנוסף, טכניקה זו ניתן להתאים בקלות בידוד של תאים עינית מועשר אחרים, עבורן תא היה קשה לבודד מעיני העכבר. השילוב של הפונקציה LCM וניתוח RNA יכול לתרום להבנה מקיפה יותר של האירועים הסלולר שבבסיס גלאוקומה.

Introduction

גלאוקומה היא קבוצה של מחלות המאופיינת נוירופתיה אופטית, רטינופתיה שמוביל בסופו של דבר לעיוורון בלתי הפיך1,2. ההערכה היא כי על ידי 2020 נגמר אגור 70 מיליון אנשים ברחבי העולם עם צורה כלשהי של המחלה3,4,5,6,7. ראשי פתוח גלאוקומה (POAG), הסוג הנפוץ ביותר של גלאוקומה, מאופיינת בירידת יצוא aqueous הומור (AH) שמוביל מוגברת לחץ תוך-עיני (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. IOP אינה מטופלת כראוי, באופן כרוני מוגברות השמאלי מוביל לנזק הדרגתיים ובלתי הפיכים הרשתית ואת ראש עצב הראייה גרימת עיוורון רדיאלי1,2,19. כל השיטות הקיימות עבור להאט את ההתקדמות של גלאוקומה דגש על צמצום IOP, או על ידי הפחתת קצב הייצור של AH על ידי הגוף ריסי או שיפור זה תזרים1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. meshwork trabecular (TM) ממלא תפקיד חיוני בוויסות באופן פעיל את השביל הראשי של יצוא AH אשר תפקידה לא תקין הוא גורם סיבתי עבור לחץ דם גבוה גלאוקומה1,2,19. עם זאת, המנגנונים המולקולריים הקשורים בתפקוד TM איך זה מווסת AH ניקוז אינם עדיין לגמרי מובנים, נמצא כעת והמוקד העיקרי של גלאוקומה מחקר1,2,19, 20. בזמן הגנום כולו האגודה מספר מחקרים (GWAS) יש מקושרים מספר גנים גלאוקומה, עמידות מוגברת למתקן יצוא AH-ה-TM, המנגנונים המולקולריים המדויק להוביל המחלה אינם עוד מובן במלואו21 , 22 , 23 , 24 , 25.

מודלים בעלי חיים יש שיפור משמעותי שלנו הידע הנוכחי של התקדמות המחלה ב גלאוקומה (בהרחבה שבתוך3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). פותחו מספר שיטות חלוצית ללמוד TM34,35,36 , שיטות אלה היה בשימוש נרחב כדי לקדם את ההבנה הנוכחית שלנו של רקמה נורמלית וחולים. תחום אחד כי לא היה חקר בהרחבה הוא השימוש של מודלים מהונדס גנטית עכבר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של כשל TM. הטרנסגניים טוק-in ו העכבר מעלף מחקרים של גנים TM הקשורים, כגון Myocilin (Myoc)37,38 , Cyp1b139, כבר הכלים הראשי עבור הלומדים את המנגנונים המולקולריים של TM פונקציה. מובן, גודל קטן של ה-TM בעכברים מייצג משוכה רצינית שחייבים להכריעו על מנת להתחיל ללמוד הרקמה הזאת. העכבר דגמים מייצגים כלי רב עוצמה עבור ללמוד את הגנטיקה ואת המנגנונים המולקולריים של המחלה, כאשר ההתקדמות בטכנולוגיות LCM לספק את הכלים הדרושים כדי להעצים את המחקר של הרקמות הקטן ביותר ועדינים ביותר, כולל ה-TM.

בדו ח זה, מתוארת שיטה לשחזור ועמיד עבור LCM של TM מועשר מעיני העכבר יחד עם עוקבות בידוד RNA ו הגברה לניתוח ביטוי במורד הזרם. שיטות דומות שימשו בהצלחה בעכברים כדי לבודד סוגים אחרים של העין רקמות40,41,42,43,44, המתודולוגיה דיווח בזאת ניתן ליישם את השני רקמות דיסקרטית של העין ללמוד RNA, microRNA, DNA, חלבונים. חשוב לציין, טכניקה זו מאפשרת את השימוש עכברים מהונדסים כדי להבין טוב יותר בפתוגנזה מולקולרית של ליקוי TM גלאוקומה, מחלה עינית3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. היכולת לבודד את ה-TM של העכבר עיניים על ידי אופנת LCM יהיה טכניקה שימושית בהשגת עוד תובנות המנגנונים המולקולריים של מספר מחלות עינית.

Protocol

הלאומית המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS) חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (ACUC) אישר כל מתודולוגיה של מחקר זה תחת NIEHS החיה ללמוד את ההצעה IIDL 05-46. 1. אוסף רקמה אופטימלית עבור לייזר Microdissection להשיג 2 לעכברים בת 3 חודשים, זכר או נקבה C57BL/6. המתת חסד עם CO2 למשך תקופה מינימלית של 1 דקות…

Representative Results

LCM שנאסף RNA ה-TM, גוף ריסי בלבד עכברים שונים 4 היה מבודד כדי להיות מסוגל לנתח ביטוי גנים ולהשוות את הביטוי עם זה בעין כל בסקלרה, איריס, רשתית, קרנית, עדשה מבודד שלושה עכברים נפרדים. TM ביטוי הגנים, MYOC48 ו ACTA249 נותחו על כל רקמות שנאספו כדי לאשר כי…

Discussion

ה-TM ממלא תפקיד חיוני בשמירה באופן פעיל homeostatic IOP, תפקוד שלה מקובל כגורם סיבתי מרכזי עבור לחץ דם גבוה גלאוקומה1,2,19. מספר של נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים מספר גנים המזוהה על-ידי ניתוח GWAS היה קשור בסיכון מוגבר גלאוקומה עמידות מוגברת למתקן יצו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Tags

Laser MicrodissectionTrabecular MeshworkGene Expression AnalysisOcular DiseasesRNA IsolationCryostat SectioningH&E StainingLaser Capture Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image