Лазерная захвата Microdissection высоки чисто Трабекулярная сеть от мыши глаз для анализа выражения гена
Summary
Здесь мы описываем протокол для захвата microdissection воспроизводимый лазер (LCM) для изоляции Трабекулярная сеть (TM) для анализа течению РНК. Возможность анализировать изменения в экспрессии генов в НП поможет понять глубинные механизмы глазных заболеваний, связанных с ТМ.
Abstract
Лазерная захвата microdissection (LCM) позволило анализ выражения гена одной клетки и обогатили клеточных популяций в разделах ткани. LCM является отличным инструментом для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференцировки клеток и развития и прогрессирования различных заболеваний, в том числе глаукомы. Глаукома, которая включает семейство прогрессивной оптической невропатии, является наиболее распространенной причиной необратимых слепоты во всем мире. Структурные изменения и повреждения в пределах Трабекулярная сеть (TM) может привести к увеличению внутриглазного давления (ВГД), который является основным фактором риска для развития глаукомы. Однако точное молекулярных механизмов все еще плохо поняты. Способность выполнять анализ выражения гена будет иметь решающее значение в получении дальнейшее понимание функции этих клеток и его роль в регуляции ВГД и глаукома развития. Для достижения этой цели, воспроизводимый метод для изоляции высоко обогащенного ТМ от замороженной секции мыши глаза и метод для анализа выражения течению гена, такие как RT-ПЦР и РНК-Seq необходима. Метод, описанный здесь разрабатывается изолировать высоки чисто ТМ от мыши глаз вниз по течению цифровой ПЦР и анализ microarray. Кроме того этот метод может быть легко адаптирована для изоляции других высоко обогащенного глазной клеток и клеточных компартментов, которые было сложно изолировать от мыши глаз. Сочетание анализа LCM и РНК может способствовать более полное понимание сотовой событий, лежащие в основе глаукомы.
Introduction
Глаукома – это группа заболеваний, характеризуется оптической невропатии и ретинопатии, что в конечном итоге приводит к необратимой слепоте1,2. Предполагается, что к 2020 году более 70 миллионов людей во всем мире будет жить с некоторой формой болезни3,4,5,6,7. Первичной открытоугольной глаукомы (POAG), наиболее распространенным типом глаукомы, характеризуется уменьшением оттока водянистой влаги (AH), приводит к увеличению внутриглазного давления (ВГД)8,9,10, 11,12,,13143,,1516,17,18. Левый untreated, хронически повышенным ВГД приводит к прогрессивной и необратимого повреждения сетчатки и зрительного нерва голову, вызывая радиальные слепота1,2,19. Все текущие методы для замедления прогрессирования глаукомы акцент на снижение ВГД, либо снижения темпов производства Ах, цилиарного тела или повышения его отток1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. Трабекулярная сеть (TM) играет жизненно важную роль в активное регулирование основной путь оттока AH, и его неправильная функция является причинным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Однако молекулярные механизмы, связанные с дисфункцией ТМ и как он регулирует дренаж AH еще не полностью изучены и в настоящее время является одним из основных направлений глаукома исследование1,2,19, 20. Хотя несколько генома всей ассоциации исследования (GWAS) связывают ряд генов глаукомы и повышенная устойчивость к AH отток объекта на ТМ, точные молекулярные механизмы, которые приводят к болезни не являются полностью осознана21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Животные модели значительно расширили наши текущие знания о прогрессирования заболевания в глаукомы (подробно рассмотрены в3,,1516,26,27,28, 29,–30,–31,–32,–33). Некоторые новаторские методы были разработаны для изучения ТМ34,35,36 , и эти методы широко используются для продвижения нашего нынешнего понимания нормальных и пораженной ткани. Одной из областей, которые не были широко изучены является использование генетически модифицированных мыши модели для изучения молекулярных механизмов ТМ отказа. Трансгенные забивные и нокаут-мыши исследования ТМ связанных генов, например Myocilin (Myoc)37,38 и39 Cyp1b1были основными средствами для изучения молекулярных механизмов ТМ функция. Понятно, что небольшой размер ТМ в мышах представляет серьезное препятствие, которое необходимо преодолеть для того, чтобы начать учиться этой ткани. Мышь модели представляют собой мощный инструмент для изучения генетики и молекулярных механизмов заболевания, хотя достижения в области технологий LCM предоставляют необходимые инструменты для расширения возможностей исследования маленьких и самых деликатных тканей, включая ТМ.
В настоящем докладе надежных и воспроизводимых метод описан для LCM высокообогащенного ТМ от мыши глаз вместе с последующей РНК изоляции и усилители для анализа течению выражение. Подобные методы были использованы успешно мышей изолировать других типов глаз тканей40,41,42,,4344, методологии, сообщили здесь могут быть применены к другой дискретные тканях глаза для изучения белков, ДНК, РНК и микроРНК. Важно отметить, что этот метод позволяет использовать генетически измененных мышей, чтобы лучше понять молекулярный патогенез ТМ обесценения глаукомы и глазные болезни3,,1516,17 ,18,,2631,45,46. Способность изолировать ТМ мыши глаза LCM будет полезным способом в получении дальнейшее понимание молекулярных механизмов нескольких глазных заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
ТМ играет жизненно важную роль в поддержании активно гомеостатических ВГД и его дисфункции широко признается основным побудительным фактором для гипертонической глаукома1,2,19. Количество единичных нуклеотидных полиморфизмов в неско?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
