लेजर पर कब्जा Microdissection जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए माउस आंखों से अत्यधिक शुद्ध Trabecular Meshwork
Summary
यहाँ, हम बहाव आरएनए विश्लेषण के लिए trabecular meshwork (TM) को अलग करने के लिए एक reproducible लेजर कैप्चर microdissection (LCM) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. tm में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का विश्लेषण करने की क्षमता tm के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगी नेत्र रोगों से संबंधित ।
Abstract
लेजर कैप्चर microdissection (LCM) एकल कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति दी है और ऊतक वर्गों में समृद्ध कोशिका आबादी । LCM आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक महान उपकरण कोशिका विभेद अंतर्निहित और विकास और मोतियाबिंद सहित विभिन्न रोगों की प्रगति है । मोतियाबिंद, जो प्रगतिशील ऑप्टिक न्यूरोपैथी के एक परिवार शामिल है, दुनिया भर में अपरिवर्तनीय अंधापन का सबसे आम कारण है । संरचनात्मक परिवर्तन और trabecular meshwork (TM) के भीतर नुकसान intraocular दबाव (IOP) है, जो मोतियाबिंद के विकास के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है में परिणाम कर सकते हैं । हालांकि, सटीक आणविक तंत्र शामिल अभी भी खराब समझ रहे हैं । जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने की क्षमता इन कोशिकाओं के समारोह और IOP और मोतियाबिंद के विकास के विनियमन में अपनी भूमिका में आगे अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में महत्वपूर्ण होगा । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, माउस की आंखों के जमे हुए वर्गों से अत्यधिक समृद्ध TM अलग करने के लिए एक reproducible विधि और बहाव जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक विधि, जैसे आरटी-qPCR और आरएनए-Seq की जरूरत है । यहां वर्णित विधि बहाव डिजिटल पीसीआर और microarray विश्लेषण के लिए माउस आंखों से अत्यधिक शुद्ध TM को अलग करने के लिए विकसित की है । इसके अलावा, इस तकनीक को आसानी से अंय अत्यधिक समृद्ध नेत्र कोशिकाओं और सेल डिब्बों है कि मुश्किल से माउस आंखों से अलग किया गया है अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । LCM और आरएनए विश्लेषण का संयोजन सेलुलर घटनाओं अंतर्निहित मोतियाबिंद की एक अधिक व्यापक समझ के लिए योगदान कर सकते हैं ।
Introduction
मोतियाबिंद ऑप्टिक न्यूरोपैथी और रेटिनोपैथी द्वारा विशेषता रोगों का एक समूह है कि अंततः अपरिवर्तनीय दृष्टिहीनता1,2की ओर जाता है । यह अनुमान है कि २०२० से अधिक ७०,०००,००० लोगों को दुनिया भर में रोग के कुछ फार्म के साथ रह जाएगा3,4,5,6,7। प्राथमिक खुला कोण मोतियाबिंद (POAG), मोतियाबिंद के सबसे प्रचलित प्रकार, जलीय हास्य में कमी (आह) बहिर्वाह intraocular दबाव (IOP)8,9,10के लिए अग्रणी की विशेषता है, 11,12,13,143,15,16,17,18. अनुपचारित छोड़ दिया, जीर्ण ऊंचा IOP रेटिना और ऑप्टिक तंत्रिका सिर को प्रगतिशील और अपरिवर्तनीय नुकसान की ओर जाता है रेडियल अंधापन1,2,19कारण । IOP को कम करने पर मोतियाबिंद ध्यान की प्रगति को धीमा करने के लिए सभी मौजूदा तरीके, या तो सिलिअरी शरीर द्वारा आह के उत्पादन की दर कम करने या यह बहिर्वाह1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabecular meshwork (TM) सक्रिय रूप से प्राथमिक आह बहिर्वाह मार्ग और उसके अनुचित कार्य को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है ग्रस्त मोतियाबिंद1,2,19के लिए एक प्रेरणा का कारक है । हालांकि, आण्विक TM रोग के साथ जुड़े तंत्र और यह कैसे नियंत्रित आह जल निकासी अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे है और वर्तमान में मोतियाबिंद अनुसंधान1,2,19के एक प्रमुख ध्यान केंद्रित है, 20. जबकि कई जीनोम-वाइड एसोसिएशन के अध्ययन (GWAS) मोतियाबिंद के लिए जीन की एक संख्या से जुड़े हुए है और टीएम में वृद्धि प्रतिरोध आह बहिर्वाह सुविधा के लिए, सटीक आणविक तंत्र है कि रोग के लिए नेतृत्व अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे है21 , 22 , 23 , 24 , 25.
पशु मॉडल बहुत मोतियाबिंद में रोग प्रगति के हमारे वर्तमान ज्ञान को बढ़ाया है (बड़े पैमाने पर की समीक्षा की3,15,16,26,27,28, 29,30,31,३२,३३) । कई अग्रणी तरीकों TM३४,३५,३६ का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है और इन तरीकों को व्यापक रूप से सामांय और रोगग्रस्त ऊतक के बारे में हमारी वर्तमान समझ अग्रिम किया गया है । एक क्षेत्र है कि बड़े पैमाने पर पता लगाया नहीं किया गया है आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल के उपयोग के लिए TM विफलता के आणविक तंत्र का अध्ययन है । ट्रांसजेनिक नॉक-इन और नॉक-आउट माउस स्टडीज ऑफ टीएम एसोसिएटेड जीन, जैसे Myocilin (Myoc)३७,३८ और Cyp1b1३९, के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्राथमिक औजार रहे हैं TM समारोह. जाहिर है, चूहों में TM के छोटे आकार के एक गंभीर बाधा है कि आदेश में इस ऊतक का अध्ययन शुरू करने के लिए दूर किया जाना चाहिए का प्रतिनिधित्व करता है । माउस मॉडल आनुवंशिकी और रोग के आण्विक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि LCM प्रौद्योगिकियों में अग्रिम आवश्यक उपकरण प्रदान करने के लिए सबसे छोटी और सबसे नाजुक ऊतकों के अध्ययन, TM सहित सशक्त ।
इस रिपोर्ट में, एक मजबूत और reproducible विधि अत्यधिक समृद्ध TM के LCM के लिए माउस आंखों से बाद में आरएनए अलगाव के साथ वर्णित है, और बहाव अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रवर्धन । इसी तरह की विधियों का इस्तेमाल किया गया है चूहों में सफलतापूर्वक नेत्र ऊतकों के अन्य प्रकार को अलग करने के लिए४०,४१,४२,४३,४४, कार्यप्रणाली की रिपोर्ट के साथ साथ अन्य करने के लिए लागू किया जा सकता आंख के असतत ऊतकों आरएनए, microRNA, डीएनए, और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए । महत्वपूर्ण बात, इस तकनीक आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उपयोग को बेहतर ढंग से मोतियाबिंद और नेत्र रोग में TM हानि की आणविक रोगजनन समझने के लिए सक्षम बनाता है3,15,16,17 ,18,26,31,४५,४६. LCM द्वारा माउस आंखों के TM अलग करने की क्षमता कई नेत्र रोगों के आणविक तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में एक उपयोगी तकनीक होगी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
TM सक्रिय रूप से समस्थिति IOP को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और इसकी शिथिलता ग्रस्त मोतियाबिंद1,2,19के लिए मुख्य प्रेरणा का कारक के रूप में स्वीकार कर लिय?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
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