JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Laser Capture lokalt av högt rent trabekelverket från mus ögon för gen uttryck analys

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57576
, , , , , , ,
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för en reproducerbar laser fånga lokalt (LCM) för att isolera trabekelverket (TM) för nedströms RNA analys. Förmågan att analysera förändringar i genuttryck i Översättningsminnet hjälp att förstå de bakomliggande molekylära mekanismerna för TM-relaterade ögonsjukdomar.

Abstract

Laser fånga lokalt (LCM) har tillåtet gen uttryck analys av enstaka celler och berikas cellpopulationer i vävnadssnitt. LCM är ett bra verktyg för studier av molekylära mekanismer bakom celldifferentiering och utveckling och progression av olika sjukdomar, inklusive glaukom. Glaukom, som består av en familj av progressiva fiberoptiska neuropatier, är den vanligaste orsaken till irreversibel blindhet i världen. Strukturella förändringar och skador inom den trabekulära nätverket (TM) kan resultera i ökat intraokulärt tryck (IOP), som är en stor riskfaktor för att utveckla glaukom. Dock är de exakta molekylära mekanismerna som är inblandade fortfarande bristfällig. Förmågan att utföra gen uttryck analys kommer att vara avgörande att få ytterligare insikter om funktionen av dessa celler och dess roll i regleringen av IOP och glaukom utveckling. För att uppnå detta, berikad en reproducerbar metod för att isolera mycket TM från frusna snitt av mus ögon och en metod för nedströms gen uttryck analys, såsom RT-qPCR och RNA-Seq behövs. Den metod som beskrivs häri är utvecklat för att isolera högt rena TM från mus ögon för nedströms digital PCR och microarray analys. Dessutom, kan denna teknik enkelt anpassas för isolering av andra höganrikat okulär celler och cell fack som har varit svåra att isolera från mus ögon. Kombinationen av LCM och RNA analys kan bidra till en mer omfattande förståelse av de cellulära händelser underliggande glaukom.

Introduction

Glaukom är en grupp sjukdomar som kännetecknas av optikusneuropati och retinopati som i slutändan leder till irreversibel blindhet1,2. Det uppskattas att av 2020 över 70 miljoner människor världen över kommer att leva med någon form av sjukdom3,4,5,6,7. Primär öppenvinkelglaukom (POAG), den vanligaste typen av glaukom, kännetecknas av en minskning av kammarvatten (AH) utflöde leder till förhöjt intraokulärt tryck (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Vänster obehandlade, kroniskt förhöjt IOP leder till progressiv och oåterkalleliga skador på näthinnan och synnerven huvudet orsakar radiella blindhet1,2,19. Alla nuvarande metoder för att bromsa utvecklingen av glaukom fokus på att minska IOP, antingen genom att minska produktionstakten Ah av ciliarkroppen eller förbättra dess utflöde1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. trabekelverket (TM) spelar en viktig roll i att aktivt reglera den primära AH utflöde vägen och dess felaktig funktion är en orsakande faktor för hypertensiva glaukom1,2,19. Dock de molekylära mekanismer som är associerad med TM dysfunktion och hur det reglerar AH dränering är ännu inte helt förstått och är för närvarande ett stort fokus på glaukom forskning1,2,19, 20. medan flera genome-wide associationsstudier (GWAS) har kopplat ett antal gener till glaukom och ökad motståndskraft mot AH utflöde anläggning vid TM, de exakta molekylära mekanismerna som leder till sjukdom inte är ännu förstått21 , 22 , 23 , 24 , 25.

Djurmodeller har kraftigt förbättrat vår nuvarande kunskap om sjukdomsprogression vid glaukom (utförligt recenserade i3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Flera banbrytande metoder har utvecklats för att studera den TM34,35,36 och dessa metoder har använts i stor utsträckning att avancera vår nuvarande förståelse av normala och sjuk vävnad. Ett område som inte har undersökts i stor utsträckning är användningen av genetiskt modifierade musmodeller att studera molekylära mekanismer för TM misslyckande. Transgena inpressning och knock-out mus studier av TM associerade gener, såsom Myocilin (Myoc)37,38 och Cyp1b139, har varit den primära verktygen för att studera molekylära mekanismer för TM funktion. Förståeligt, den lilla storleken på TM i möss representerar ett allvarliga hinder som måste övervinnas för att börja studera denna vävnad. Musmodeller utgör ett kraftfullt verktyg för att studera genetik och molekylära mekanismer av sjukdom, medan framstegen i LCM teknik ger de nödvändiga verktygen för att ge studien av de minsta och mest känsliga vävnader, inklusive TM.

I betänkandet beskrivs en robust och reproducerbar metod för LCM av höganrikat TM från mus ögon tillsammans med efterföljande RNA isolering och förstärkning för nedströms uttryck analys. Liknande metoder har använts framgångsrikt i möss för att isolera andra typer av ögats vävnader40,41,42,43,44, den metod som rapporteras häri kan tillämpas på andra diskreta vävnaderna i ögat att studera RNA, mikroRNA, DNA och proteiner. Viktigast av allt, möjliggör denna teknik användning av genetiskt modifierade möss att bättre förstå de molekylära mekanismer av TM hos glaukom och okulär sjukdom3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. Möjligheten att isolera TM mus ögon av LCM blir en användbar teknik att få ytterligare insikter om molekylära mekanismer för flera ögonsjukdomar.

Protocol

De nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) djur vård och användning kommittén (ACUC) godkände alla metodiken för denna studie under den NIEHS djur studera förslaget IIDL 05-46. 1. optimala vävnad samling för Laser lokalt Skaffa 2 till 3 månader gamla möss, manliga eller kvinnliga C57BL/6. Eutanasi med CO2 för minst 1 min eller tills andning har upphört. Ta bort djuret från buren och försäkra döden genom antingen cervikal dislokation, h…

Representative Results

LCM samlas RNA från TM och ciliarkroppen från 4 olika möss var isolerad för att kunna analysera genuttryck och jämföra uttrycket med det i hela ögat, sklera, iris, näthinnan, hornhinnan och linsen isolerade från tre separata möss. TM uttrycker gener, analyserades MYOC48 och ACTA249 i alla insamlade vävnader att bekräfta att de isolera TM proverna var verkligen höganrikat i TM. På grund av den extremt låga mä…

Discussion

TM spelar en viktig roll i att aktivt bibehålla homeostatiska IOP och dess dysfunktion är allmänt accepterat som den viktigaste orsakande faktorn för hypertensiva glaukom1,2,19. Ett antal enda nukleotid polymorfismer i flera gener identifierats GWAS analys har kopplats till ökad glaukom risk och ökat motstånd mot AH utflöde anläggning vid TM; dock är de exakta molekylära mekanismer som ger upphov till denna sjukdom ä…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Tags

Laser MicrodissectionTrabecular MeshworkGene Expression AnalysisOcular DiseasesRNA IsolationCryostat SectioningH&E StainingLaser Capture Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image