Polysoom profilering in Leishmania, menselijke cellen en muis Testis
Summary
Het algemene doel van Polysoom profiling techniek is analyse van translationeel activiteiten van individuele mRNAs of transcriptome mRNAs tijdens de eiwitsynthese. De methode is belangrijk voor de studie van eiwit synthese verordening, vertaling activering en onderdrukking in gezondheid en meerdere ziekten bij de mens.
Abstract
Goede eiwit expressie op het juiste moment en in de juiste hoeveelheden is de basis van normale cel functie en overleven in een snel veranderende omgeving. Voor een lange tijd, werden de gen expressie studies gedomineerd door onderzoek op het transcriptional niveau. Echter de steady-state niveaus van mRNAs doen niet correleren goed met de productie van eiwitten en de vertaalbaarheid van mRNAs varieert afhankelijk van de omstandigheden. In sommige organismen, zoals de parasiet, Leishmania, is het eiwit expressie meestal op de translationeel niveau geregeld. Recente studies aangetoond dat eiwitten vertaling disregulatie wordt geassocieerd met kanker, metabole, neurodegeneratieve en andere ziekten bij de mens. Polysoom profilering is een krachtige methode om te studeren eiwit vertaling verordening. U kunt de translationeel status van individuele mRNAs meten of de vertaling op de schaal van een genoom-brede onderzoeken. De basis van deze techniek is de scheiding van polysomes, ribosomen, subeenheden en gratis mRNAs tijdens centrifugeren van een cytoplasmatische lysate via een verloop van sacharose. Hier presenteren we een universele Polysoom profiling protocol dat wordt gebruikt op drie verschillende modellen – parasiet, Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en dierlijke weefsels. Leishmania cellen groeien vrij in suspensie en gekweekte menselijke cellen groeien in aanhangend enkelgelaagde, terwijl muis testis een dierlijk weefsel steekproef. De techniek is dus aangepast aan elk van deze bronnen. Het protocol voor de analyse van polysomal breuken bevat detectie van individuele mRNA niveaus door RT-qPCR, eiwitten door westelijke vlek en analyse van ribosomaal RNAs door elektroforese. De methode kan worden uitgebreid door onderzoek van mRNAs vereniging met het ribosoom op een niveau van transcriptome door diepe RNA-seq en analyse van ribosoom-geassocieerde eiwitten door massaspectrometrie van de fracties. De methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere biologische modellen.
Introduction
Verordening van genexpressie in cellen wordt gecontroleerd door middel van de mechanismen van transcriptionele, posttranscriptional en posttranslationele. Vooruitgang in de diepe RNA sequencing toestaan de studie van de stationaire toestand mRNA niveaus op de schaal van een genoom-brede op een ongeëvenaard niveau. Echter, recente bevindingen bleek dat steady-state mRNA niveau niet altijd met eiwit productie1,2 correleren. Het lot van een individuele transcript is zeer complex en hangt af van vele factoren zoals interne/externe prikkels, stress, enz. Verordening van de genexpressie tijdens de eiwitsynthese biedt een andere laag van expressie controle nodig zijn voor een snelle reactie in veranderende omstandigheden. Polysoom (of “polyribosome”) profilering, de scheiding en de visualisatie van actief vertalen ribosomen, is een krachtige methode om te studeren van de regulering van de eiwitsynthese. Hoewel, de eerste experimentele toepassingen verscheen in de jaren 1960-3, is Polysoom profilering momenteel een van de belangrijkste technieken in eiwit vertaling studies4. Enkele mRNAs kan worden vertaald door meer dan één ribosoom leidt tot de vorming van een Polysoom. Afschriften kunnen worden geblokkeerd op ribosomen met cycloheximide5 en mRNAs met verschillende nummers van polysomes kunnen worden gescheiden in het proces van Polysoom fractionering door sacharose kleurovergang ultracentrifugatie6,7 , 8 , 9. RNA analyse van polysomal breuken laat dan meting van veranderingen in de translationeel Staten van individuele mRNAs op genoom-brede schaal en tijdens verschillende fysiologische omstandigheden4,7, 10. de methode is ook gebruikt voor het onthullen van de rollen van 5′ UTR en 3′ UTR sequenties in controle van mRNA vertaalbaarheid11, de rol van miRNAs in translationeel repressie12onderzoeken, ontdekken van defecten in ribosoom biogenese13 , en begrijpen van de rol van ribosoom-geassocieerde eiwitten met ziekten bij de mens14,15. Tijdens de afgelopen tien jaar, is een steeds grotere rol voor de regulering van de genexpressie tijdens de vertaling gebleken dat het belang ervan voor ziekten bij de mens illustreert. Het bewijs voor translationeel controle in kanker, metabole en neurodegeneratieve ziekten is overweldigend15,16,17,18. Bijvoorbeeld disregulatie van eIF4E-afhankelijke vertalende controle draagt bij aan autisme gerelateerde tekorten15 en FMRP is betrokken bij vastlopen van ribosomen op mRNAs gekoppeld aan autisme14. Polysomal profilering is dus een zeer belangrijk instrument om te studeren fouten in translationeel verordening in meerdere ziekten bij de mens.
Eiwit analyse van polysomal breuken onder verschillende fysiologische omstandigheden ontleedt de functie van factoren die samenhangen met ribosomen tijdens de vertaling. De Polysoom profiling techniek is gebruikt in vele soorten, met inbegrip van gist, cellen van zoogdieren, planten en protozoa10,19,20,21. Eencellige parasieten zoals Trypanosoma en Leishmania vertonen beperkte Transcriptionele controle op de genexpressie. Hun genoom worden ingedeeld in polycistronic gen clusters die geen promotor-gereglementeerde transcriptie22. In plaats daarvan, developmental genexpressie wordt voornamelijk geregeld op het niveau van eiwit vertaling en mRNA stabiliteit in trypanosomatid soorten23,24. Begrip voor translationeel control in de afwezigheid van transcriptionele verordening is daarom bijzonder belangrijk voor deze organismen. Polysomal profilering is een krachtig hulpmiddel om te studeren van posttranscriptional regulering van genexpressie in Leishmania25,26,27,28.
De recente vooruitgang in de opsporing van individuele mRNAs niveaus door real time kwantitatieve PCR (RT-qPCR) en volledige transcriptome door next-generation sequencing, evenals proteomics technologieën, resolutie en voordelen van polysomal profielen naar een nieuw niveau brengt. Het gebruik van deze methoden kan worden uitgebreid door analyse van individuele polysomal breuken door diepe RNA sequencing gecombineerd met Proteoom analyse om de translationeel status van cellen in een genoom-brede schaal te controleren. Hierdoor is de identificatie van nieuwe moleculaire spelers regulering van de vertaling in de verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden. Hier presenteren we een universele Polysoom profilering protocol dat wordt gebruikt op drie verschillende modellen: de parasiet, Leishmania grote, gekweekte menselijke cellen en dierlijke weefsels. Over de voorbereiding van cel lysates presenteren we advies van verschillende organismen, optimalisatie van de helling, mits het, keuze van RNase remmers en toepassing van RT-qPCR, westelijke vlek en RNA elektroforese te analyseren Polysoom breuken in deze studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysoom fractionering door sacharose verloop in combinatie met RNA en eiwit analyse van breuken is een krachtige methode voor het analyseren van translationeel status van individuele mRNAs of de hele translatome en rollen van proteïne factoren reguleren translationeel machine tijdens normale fysiologische of ziekte staat. Polysomal profilering is een speciaal geschikt techniek te studeren translationeel verordening in organismen zoals trypanosomatids, met inbegrip van Leishmania waar Transcriptionele controle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Ching Lee voor hulp met audio-opname. Het onderzoek werd gesteund door de Start-up middelen uit Texas Tech University Health Sciences Center en door het Center of Excellence voor translationele neurowetenschappen en Therapeutics (CTNT) toekennen PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; gedeeltelijk door de NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman en Kristen R. Baca waren CISER (centrum voor de integratie van STEM onderwijs & onderzoek) geleerden en werden ondersteund door het programma.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
