Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania
Summary
L’obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l’attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.
Abstract
Espressione della proteina corretta al momento giusto e nelle giuste quantità è alla base della funzione normale delle cellule e la sopravvivenza in un ambiente veloce-cambiante. Per lungo tempo, gli studi di espressione genica sono stati dominati dalla ricerca al livello trascrizionale. Tuttavia, i livelli allo stato stazionario di mRNA non correlano bene con la produzione di proteine, e la traducibilità dei mRNAs varia notevolmente a seconda delle condizioni. In alcuni organismi, come il parassita Leishmania, l’espressione della proteina è regolata principalmente a livello traduzionale. Studi recenti hanno dimostrato che dysregulation di traduzione della proteina è associata con cancro, metabolico, neurodegenerative e altre malattie umane. Polisoma profiling è un metodo potente per studiare il regolamento della proteina di traduzione. Permette di misurare lo stato traduzionale di singoli mRNA o esaminare la traduzione su scala genomica. La base di questa tecnica è la separazione di polisomi, ribosomi, loro subunità e mRNAs gratuito durante la centrifugazione di un pattern citoplasmatico lisato attraverso un gradiente di saccarosio. Qui, presentiamo un protocollo profilatura polisoma universale utilizzato su tre diversi modelli – parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Leishmania cellule crescono liberamente in sospensione e cellule umane coltivate crescono nello strato monomolecolare aderente, mentre testicolo di topo rappresenta un campione di tessuto animale. Così, la tecnica si adatta a tutte queste fonti. Il protocollo per l’analisi delle frazioni polisomici include rilevamento dei singoli livelli di mRNA di RT-qPCR, proteine mediante Western blot e analisi di RNA ribosomiale (rRNA) tramite l’elettroforesi. Il metodo può essere ulteriormente esteso da esame dell’associazione di mRNA con il ribosoma a livello del trascrittoma di profonda RNA-seq e analisi delle proteine associate ribosoma di spettroscopia di massa delle frazioni. Il metodo può essere facilmente regolato ad altri modelli biologici.
Introduction
Regolazione dell’espressione genica in cellule è controllata da meccanismi trascrizionali, post-trascrizionale e post-traduzionali. Progressi nel sequenziamento di RNA profondo consentono lo studio dei livelli di mRNA di stazionario su scala genomica a un livello senza precedenti. Tuttavia, recenti scoperte hanno rivelato che il livello di mRNA allo steady-state non correla sempre con proteina produzione1,2. Il destino di una trascrizione individuale è molto complesso e dipende da molti fattori come stress, stimoli interni/esterni, ecc. Regolazione dell’espressione genica durante la sintesi delle proteine fornisce un ulteriore livello di controllo necessario per una risposta rapida in condizioni di cambiamento di espressione. Profili, la separazione e la visualizzazione di tradurre attivamente ribosomi, polisoma (o “polyribosome”) è un metodo efficace per studiare la regolazione della sintesi proteica. Anche se le prime applicazioni sperimentali è apparso in the 1960s3, polisoma profilatura è attualmente una delle tecniche più importanti nella proteina traduzione studi4. Singolo mRNA può essere tradotto da più di un ribosoma che portano alla formazione di un polisoma. Le trascrizioni possono essere bloccate sui ribosomi con cicloesimmide5 e mRNA contenente diversi numeri di polisomi possa essere separati nel processo di frazionamento polisoma da saccarosio ultracentrifugazione di pendenza6,7 , 8 , 9. analisi di RNA delle frazioni polisomici quindi permette la misura dei cambiamenti negli Stati traduzionali di singoli mRNA su scala genomica e durante diverse condizioni fisiologiche4,7, 10. il metodo è stato utilizzato anche per rivelare i ruoli di 5′ UTR e 3′ UTR sequenze nel controllo di mRNA traducibilità11, esaminare il ruolo dei miRNA nella repressione traduzionale12, difetti nella biogenesi dei ribosomi13 e comprendere il ruolo delle proteine associate ribosoma con malattie umane14,15. Durante l’ultimo decennio, un ruolo sempre più importante per la regolazione dell’espressione genica durante la traduzione è emerso che illustra la sua importanza nelle malattie umane. La prova per controllo traduzionale in cancro, metabolico e malattie neurodegenerative è schiacciante15,16,17,18. Ad esempio, disregolazione del controllo traduzionale eIF4E-dipendente contribuisce all’autismo relativi deficit15 e FMRP è coinvolto in stallo dei ribosomi su mRNA legati all’autismo14. Così, profili polisomici è uno strumento molto importante per studiare i difetti nella regolazione traduzionale in malattie umane multiple.
Analisi della proteina di polisomici frazioni in differenti condizioni fisiologiche analizza la funzione dei fattori connessi con i ribosomi durante la traduzione. La tecnica di profilatura polisoma è stata utilizzata in molte specie tra cui il lievito, le cellule di mammiferi, piante e protozoi10,19,20,21. Protozoi parassiti come Trypanosoma e Leishmania esibiscono limitato controllo trascrizionale dell’espressione genica. Loro genomi sono organizzati in cluster di geni coregolati polycistronic che la mancanza di trascrizione promotore-regolato22. Invece, espressione genica inerente allo sviluppo è controllato principalmente al livello della proteina traduzione e stabilità del mRNA in Trypanosomatidae specie23,24. Di conseguenza, la comprensione del controllo traduzionale in assenza di regolazione trascrizionale è particolarmente importante per questi organismi. Profilatura polisomici è un potente strumento per studiare la regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica in Leishmania25,26,27,28.
I recenti progressi nella rilevazione dei livelli di singoli mRNA dal real tempo quantitative PCR (RT-qPCR) e completo trascrittoma di sequenziamento di nuova generazione, nonché tecnologie di proteomica, offre una risoluzione e vantaggi di profilatura polisomici ad un nuovo livello. L’uso di questi metodi può essere ulteriormente esteso dall’analisi delle singole frazioni polisomici di sequenziamento di RNA profondo combinato con analisi proteomica per monitorare lo stato traduzionale delle cellule su una scala di genoma. Ciò permette l’individuazione di nuovi giocatori molecolari che regolano la traduzione sotto differenti condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo un polisoma universale protocollo utilizzato su tre diversi modelli di analisi: il parassita maggiore di Leishmania, cellule umane coltivate e tessuti animali. Vi presentiamo consigli sulla preparazione dei lisati cellulari da organismi differenti, ottimizzazione delle condizioni di gradiente, scelta di inibitori della RNAsi e applicazione di RT-qPCR, Western blot ed elettroforesi del RNA per analizzare le frazioni polisoma in questo studio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frazionamento di polisoma di gradiente di saccarosio combinato con RNA e proteina analisi delle frazioni è un metodo potente per analizzare stato traduzionale di singoli mRNA o l’intero translatome e anche ruoli di fattori proteici regolazione traduzionale macchinari durante il normale stato fisiologico o malattia. Profilatura polisomici è una tecnica particolarmente adatta per studiare la regolazione traduzionale in organismi come trypanosomatids tra cui Leishmania dove controllo trascrizionale è praticament…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Ching Lee per aiuto con la registrazione audio. La ricerca è stata sostenuta dai fondi di Start-up da Texas Tech University Health Sciences Center e per il centro di eccellenza per neuroscienze traslazionali e Therapeutics (CTNT) concede PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; in parte da grant di NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca erano studiosi CISER (centro per l’integrazione di staminali formazione & ricerca) e sono stati sostenuti dal programma.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
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