Polysome Leishmania, 인간 세포 및 마우스 고환에서 프로 파일링
Summary
Polysome 프로 파일링 기술의 전반적인 목표 단백질 합성 하는 동안 개별 mRNAs 또는 transcriptome mRNAs의 변환 활동의 분석입니다. 방법은 단백질 합성 규제, 번역 활성화 및 건강과 여러 인간의 질병에 억압의 연구에 대 한 중요 합니다.
Abstract
적절 한 단백질 식 및 오른쪽 금액에 적절 한 시기에 정상적인 세포 기능 및 빠르게 변화 하는 환경에서 생존의 기초 이다. 오랜 동안에, 유전자 표현 연구 transcriptional 수준에 대 한 연구에 의해 지배 되었다. 그러나, mRNAs의 정상 수준을 잘 단백질 생산, 연관 되지 않습니다 그리고 translatability mRNAs의 조건에 따라 크게 다릅니다. Leishmania, 기생충 같은 몇몇 유기 체에서 단백질 식이 주로 변환 수준에서 통제 된다. 최근 연구는 단백질 번역 dysregulation는 암, 대사, 신경 및 기타 인간의 질병 관련 된 시연 했다. Polysome 프로 파일링 단백질 번역 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 그것은 개별 mRNAs의 변환 상태를 측정 하거나 게놈 넓은 규모에 번역을 검토 수 있습니다. 이 기법의 기초 polysomes, 리보솜, 그들의 소 단위 및 자당 그라디언트를 통해 lysate는 세포질의 원심 분리 동안 무료 mRNAs의 분리 이다. 여기, 우리가 현재 보편적인 polysome 프로 파일링 사용 되는 프로토콜에 세 가지 모델-기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. Leishmania 셀 서 스 펜 션에서 자유롭게 성장 하 고 마우스 고환 동물 조직 샘플을 나타내는 부착 단층에서 경작된 한 인간 세포 성장. 따라서, 기술은 이러한 소스의 모든 적응 이다. Polysomal 분수의 분석을 위한 프로토콜 개별 mRNA 수준의 실시간 정량 Pcr에 의해 서쪽 오 점 및 전기 이동 법에 의해 리보솜 RNAs의 분석에 의해 단백질의 탐지를 포함 한다. 메서드는 분수의 질량 분광학에 의해 mRNAs 연관 깊은 RNA-seq에 의해 transcriptome 수준에 리보솜의 검사 및 리보솜 관련 단백질의 분석에 의해 더 확장할 수 있다. 메서드는 다른 생물 학적 모델을 쉽게 조정할 수 있습니다.
Introduction
세포에 있는 유전자 발현의 규칙 transcriptional, posttranscriptional 및 posttranslational 메커니즘에 의해 제어 됩니다. 깊은 RNA 시퀀싱에서 전례 없는 수준에 게놈 넓은 규모에 정상 mRNA 수준의 연구를 수 있습니다. 그러나, 최근 연구 결과 밝혀 정상 mRNA 수준은 단백질 생산1,2와 항상 연결 되지 않습니다. 개별 성적표의 운명 매우 복잡 하 고 내부/외부 자극, 스트레스 등과같은 많은 요인에 따라 달라 집니다. 단백질 종합 동안에 유전자 발현의 규칙 변화에 신속한 대응에 필요한 식 컨트롤의 또 다른 레이어를 제공 합니다. 프로 파일링, 분리 및 리보솜, 적극적으로 번역의 시각화 polysome (또는 “polyribosome”) 단백질 종합의 규칙을 공부 하는 강력한 방법입니다. 비록, 그것의 첫번째 실험적인 응용 프로그램 1960 년대3에 등장, polysome 프로 파일링은 현재 단백질 번역 연구4에서 가장 중요 한 기술 중 하나. 단일 mRNAs는 polysome의 형성을 선도 하는 하나 이상의 리보솜에 의해 번역 될 수 있다. 성적 증명서 cycloheximide5 리보솜에 지연 수 있습니다 및 mRNAs polysomes의 다른 숫자를 포함 하 여 자당 그라데이션 ultracentrifugation6,7 polysome 분류 과정에서 분리 될 수 있다 , 8 , 9. polysomal 분수의 RNA 분석 수 있습니다 개별 mRNAs의 변환 상태에 변화의 측정 및 다른 생리 적인 조건4,7, 중 게놈 넓은 규모에 10. 5′ UTR 및 3′ UTR 시퀀스 mRNA translatability11의 제어의 역할을 공개, 번역 상 진압12miRNAs의 역할을 검토, 리보솜 속13에에서 결함을 밝히기 메서드를 또한 사용 , 인간의 질병14,15리보솜 관련 단백질의 역할을 이해 하 고. 지난 10 년 동안 번역 중 유전자 발현의 규칙을 위한 성장 역할 인간의 질병에 그것의 중요성을 나타내는 등장 했습니다. 암, 대사에 변환 제어 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 증거는 압도적인15,,1617,18. EIF4E-종속 변환 제어의 dysregulation에 기여 하는 예를 들어 자폐증 관련 적자15 와 FMRP은 자폐증14에 연결 된 mRNAs에 리보솜의 연기에 참여 하 고. 따라서, polysomal 프로 파일링 변환 여러 인간 질병에 있는 결함을 공부 하는 매우 중요 한 도구입니다.
다른 생리 적인 조건 하에서 polysomal 분수의 단백질 분석 번역 중 리보솜과 관련 된 요인의 기능 dissects. Polysome 프로 파일링 기법 등 효 모, 포유류 세포, 식물, 원생 동물10,19,,2021많은 종에서 사용 되었습니다. Trypanosoma 등 Leishmania protozoan 기생충 유전자 발현의 제한 된 transcriptional 제어를 전시 한다. 그들의 유전자는 polycistronic 유전자 클러스터 발기인 통제 전사22부족으로 구성 됩니다. 대신, 발달 유전자 발현은 주로 단백질 번역 및 trypanosomatid 종23,24에 mRNA 안정성의 수준에서 제어 됩니다. 따라서, 이해 transcriptional 규칙의 부재에서 변환 제어의이 유기 체에 대 한 특히 중요 하다. Polysomal 프로 파일링 Leishmania25,26,,2728에 유전자 발현의 posttranscriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 강력한 도구입니다.
진짜 개인적인 mRNAs 레벨의 검출에 최근 진행 시간 정량 PCR (RT-정량) 및 차세대 시퀀싱, 프로 테오 믹스 기술에 의해 전체 transcriptome, 해상도 새로운 수준 polysomal 프로 파일링의 장점을 제공 합니다. 이러한 메서드를 사용 하 여 깊은 RNA 시퀀싱 proteomic 분석 게놈 넓은 규모에 셀의 변환 상태를 모니터링을 결합 하 여 개별 polysomal 분수의 분석에 의해 더 확장 수 있습니다. 다른 생리 적 및 병 적인 조건 하에서 번역을 규제 하는 새로운 분자 선수의 식별 수 있습니다. 여기, 우리는 세 가지 모델에 사용 되는 프로토콜을 프로 파일링 범용 polysome 제시: 기생충 주요 Leishmania, 경작된 한 인간 세포 및 동물의 조직. 우리는 다른 유기 체, 그라데이션 조건의 최적화, RNase 억제제의 선택과 polysome 분수가이 연구에서 분석 하는 실시간 정량, 서쪽 오 점 및 RNA 전기 이동 법의 응용 프로그램에서 세포 lysates의 준비에 조언을 제시.
Protocol
Representative Results
Discussion
자당 기온 변화도 의해 polysome 분별 RNA와 결합 및 분수의 단백질 분석은 개별 mRNAs 또는 전체 translatome의 변환 상태 뿐만 아니라 변환 조절 단백질 요인의 역할을 분석 하는 강력한 방법을 정상적인 생리 적 또는 질병 상태 기계입니다. Polysomal 프로 파일링은 Leishmania transcriptional 제어 크게 결 석 하 고 유전자 표현 규제는 주로 발생을 포함 하는 trypanosomatids와 같은 유기 체에 있는 변환 규칙을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 오디오 녹음에 대 한 칭이 감사합니다. 연구 택 사스 기술 대학 건강 과학 센터에서 창업 자금에 의해 지원 되었다 및 변환 신경 과학 및 치료제 (CTNT) 우수의 센터에 의해 부여 PN CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; NIH 교부 금에 의해 부분에서 R01AI099380 K.Z. 제임스 C. 퍼레이드와 순 영 R. Baca CISER (줄기의 통합 교육 및 연구를 위한 센터) 학자 고 프로그램에 의해 지원 되었다.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
