Polysome de criação de perfil em Leishmania, células humanas e testículo de rato
Summary
O objectivo geral da técnica de criação de perfil de polysome é análise da actividade translacional de mRNAs individuais ou mRNAs transcriptome durante a síntese de proteína. O método é importante para estudos de regulamento de síntese de proteínas, ativação de tradução e repressão em saúde e várias doenças humanas.
Abstract
Expressão de proteínas adequada na hora certa e na quantidade certa é a base da função celular normal e sobrevivência em um ambiente de rápida mudança. Por um longo tempo, os estudos de expressão do gene foram dominados pela pesquisa sobre o nível transcricional. No entanto, os níveis de estado estacionário de mRNAs não se correlacionam bem com a produção de proteína, e a Traduzibilidade dos mRNAs próprios varia muito dependendo das condições. Em alguns organismos, como o parasita Leishmania, a expressão da proteína é regulada principalmente no nível de translação. Estudos recentes demonstraram que essa proteína tradução hipotalâmica é associada com câncer, metabólica, neurodegenerativas e outras doenças humanas. Polysome de criação de perfil é um poderoso método para estudar o Regulamento de tradução da proteína. Permite medir o status translacional de mRNAs individuais ou examinar tradução na escala do genoma. A base desta técnica é a separação de polissomos, ribossomos, suas subunidades e mRNAs gratuito durante a centrifugação de uma citoplasmática lisados através de um gradiente de sacarose. Aqui, apresentamos um polysome universal de perfil protocolo usado em três modelos diferentes – parasita Leishmania major, culturas de células humanas e tecidos animais. Células de Leishmania crescem livremente em suspensão e culturas de células humanas crescem em monocamada aderente, enquanto o testículo de rato representa uma amostra de tecido animal. Assim, a técnica é adaptada a todas estas fontes. O protocolo para a análise das frações polysomal inclui detecção de níveis de mRNA individuais por RT-qPCR, proteínas por Western blot e análise de RNAs ribossomal por eletroforese. O método pode ser novamente prorrogado por exame de mRNAs associação com o ribossoma num nível transcriptoma por RNA-seq profunda e análise de proteínas associadas Ribossoma por espectroscopia de massa das frações. O método pode ser facilmente ajustado para outros modelos biológicos.
Introduction
Regulação da expressão gênica em células é controlada por mecanismos transcriptional, posttranscriptional e pós-traducional. Avanços no sequenciamento de RNA profundo permitam o estudo dos níveis de mRNA de estado estacionário no genoma escala em um nível sem precedentes. No entanto, descobertas recentes revelaram que nível de mRNA de estado estacionário não sempre se correlaciona com a produção de proteína1,2. O destino de uma transcrição individual é muito complexo e depende de muitos fatores, como estímulos internos/externos, stress, etc. Regulação da expressão gênica durante a síntese de proteína fornece outra camada de controle de expressão necessária para uma resposta rápida na mudança de condições. Polysome (ou “polyribosome”) de criação de perfil, a separação e visualização de ativamente traduzir ribossomas, é um poderoso método para estudar a regulação da síntese de proteínas. Embora, suas primeiras aplicações experimentais apareceram na década de 19603, polysome perfil é atualmente uma das técnicas mais importantes na proteína tradução estudos4. MRNAs único pode ser traduzidos por mais de um ribossoma, levando à formação de um polysome. As transcrições podem ser paralisadas em ribossomas com cicloheximida5 e mRNAs contendo números diferentes de polissomos podem ser separados no processo de fracionamento de polysome por ultracentrifugação gradiente de sacarose6,7 , 8 , 9. análise de RNA de frações polysomal então permite a medição de mudanças nos Estados translacionais de mRNAs individuais no genoma-larga escala e durante diferentes condições fisiológicas4,7, 10. o método também tem sido usado para revelar os papéis de 5′ UTR e 3′ UTR sequências no controle do mRNA Traduzibilidade próprios11, examinar o papel dos miRNAs em repressão traducional12, descobrir defeitos na biogênese Ribossoma13 e compreender o papel das proteínas Ribossoma-associados com doenças humanas14,15. Durante a última década, um crescente papel para regulação da expressão gênica durante a tradução emergiu que ilustra a sua importância em doenças humanas. A evidência para controle de translação em câncer, metabólica e doenças neurodegenerativas é esmagadora15,16,17,18. Por exemplo, a desregulação do controle traducional eIF4E-dependente contribui para autismo relacionados com os défices15 e FMRP está envolvido em empatar de ribossomos na mRNAs ligados ao autismo14. Assim, polysomal de criação de perfil é uma ferramenta muito importante para estudar os defeitos no Regulamento translacional em várias doenças humanas.
Análise de proteínas de frações polysomal sob diferentes condições fisiológicas disseca a função dos fatores associados a ribossomas durante a tradução. A técnica de polysome de perfil tem sido usada em muitas espécies, incluindo leveduras, células de mamíferos, plantas e protozoários10,19,20,21. Protozoários parasitas como o Trypanosoma e Leishmania exibem limitado controle transcricional da expressão do gene. Seus genomas são organizadas em clusters de gene policistrônico que falta a transcrição regulada promotor22. Em vez disso, a expressão gênica no desenvolvimento é predominantemente controlada ao nível da tradução de proteínas e estabilidade do mRNA em Trypanosomatidae espécie23,24. Portanto, a compreensão do controle translacional na ausência de regulamento transcriptional é particularmente importante para estes organismos. Perfil polysomal é uma ferramenta poderosa para estudar posttranscriptional regulação da expressão gênica em Leishmania25,26,,27,28.
Os recentes progressos na detecção de níveis de mRNAs individuais pelo real tempo PCR quantitativo (RT-qPCR) e transcriptoma completa por sequenciamento de próxima geração, bem como tecnologias de proteômica, traz a resolução e as vantagens de polysomal perfil a um novo nível. A utilização desses métodos pode ser estendida ainda mais através da análise das frações de polysomal individuais por sequenciamento de RNA profundo combinado com análise proteômica para monitorar o status de translação de células na escala do genoma. Isto permite a identificação de novos jogadores moleculares regulamenta tradução sob diferentes condições fisiológicas e patológicas. Aqui, apresentamos um polysome universal de perfil protocolo usado em três modelos diferentes: o parasita Leishmania major, culturas de células humanas e tecidos animais. Apresentamos o Conselho sobre a preparação de lisados celulares de organismos diferentes, otimização das condições de gradiente, escolha de inibidores de RNase e aplicação de RT-qPCR, Western blot e eletroforese de RNA para analisar frações de polysome neste estudo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fracionamento de polysome por gradiente de sacarose combinado com RNA e proteína análise de frações é um poderoso método para analisar o status translacional de mRNAs individuais ou a translatome toda, bem como funções de fatores de proteína regulação traducional máquinas durante o estado fisiológico ou doença normal. Perfil polysomal é uma técnica especial apropriada para estudar Regulamento translacional em organismos como tripanossomatídeos incluindo Leishmania onde controle transcricional é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Ching Lee ajuda com gravação de áudio. A pesquisa foi apoiada pelos fundos de start-up da Texas Tech University Centro de Ciências da saúde e pelo centro de excelência de neurociência translacional e terapêutica (Miocardite) concede PN-Miocardite 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; em parte, pela concessão de NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman e Kristen R. Baca foram estudiosos CISER (centro para a integração da haste Educação & pesquisa) e foram apoiadas pelo programa.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
