Polysome profilering i Leishmania, mänskliga celler och mus Testis
Summary
Det övergripande målet för polysome profilering teknik är analys av enskilda mRNA eller transkriptom mRNA translationell verksamhet under proteinsyntesen. Metoden är viktigt för studier av proteinsyntes förordning, översättning aktivering och förtryck i hälsa och flera mänskliga sjukdomar.
Abstract
Ordentlig proteinuttryck vid rätt tidpunkt och i rätt mängd är grunden för normal cellfunktion och överlevnad i en snabbt föränderlig miljö. Under en lång tid dominerades gen uttryck studierna av forskning på transkriptionell nivå. Dock steady-state nivåerna av mRNA korrelerar inte väl med proteinproduktion och översättbarhet av mRNA varierar kraftigt beroende på förutsättningarna. I vissa organismer, som parasiten Leishmania, regleras proteinuttryck mestadels på translationell nivå. Nyligen genomförda studier visat att protein översättning dysreglering är associerad med cancer, metabola, neurodegenerativa och andra mänskliga sjukdomar. Polysome profilering är en kraftfull metod att studera protein översättning förordning. Det gör att mäta translationell status för enskilda mRNA eller undersöka översättning i genome-wide skala. Grunden för denna teknik är avskiljandet av polysomes, ribosomer, deras subenheter och gratis mRNA under centrifugering av en cytoplasmiska lysate genom en sackaros övertoning. Här presenterar vi en universell polysome profilering protokollet används på tre olika modeller – parasit Leishmania stora, odlade mänskliga celler och djurvävnader. Leishmania cellerna växer fritt i suspension och odlade mänskliga celler växa i vidhäftande enskiktslager, medan mus testiklarna representerar ett djur vävnadsprov. Tekniken är således anpassas efter alla dessa källor. Protokollet för analys av polysomal fraktioner omfattar identifiering av enskilda mRNA nivåer av RT-qPCR, proteiner genom Western blot och analys av ribosomalt RNA genom elektrofores. Metoden kan förlängas ytterligare genom undersökning av mRNA association med Ribosomen på transkriptom nivå av djup RNA-seq och analys av Ribosomen-associerade proteiner av massa spektroskopi av fraktioner. Metoden kan enkelt justeras till andra biologiska modeller.
Introduction
Reglering av genuttryck i cellerna styrs av transkriptionell, postttransskriptionell och posttranslationalen mekanismer. Framsteg i djupa RNA-sekvensering tillåter studier av steady state mRNA nivåer i genome-wide skala på en oöverträffad nivå. Nya rön har dock visat att steady state mRNA nivå inte alltid korrelerar med protein produktion1,2. Ödet för en enskild utskrift är mycket komplex och beror på många faktorer som inre och yttre stimuli, stress, etc. Reglering av genuttryck under proteinsyntesen ger ytterligare ett lager av uttrycket kontroll behövs för en snabb reaktion på förändrade villkor. Polysome (eller ”polyribosome”) profilering, separation och visualisering av aktivt översätta ribosomer, är en kraftfull metod att studera regleringen av proteinsyntes. Även dess första experimentella program visades i 1960-talet3, är polysome profilering för närvarande en av de viktigaste teknikerna i protein översättning studier4. Enda mRNA kan översättas av mer än en ribosom leder till bildandet av en polysome. Utskrifter kan vara stannat på ribosomerna med Kungliga Automobilklubben5 och mRNA som innehåller olika antal polysomes kan separeras i processen polysome fraktionering av sackaros gradient ultracentrifugering6,7 , 8 , 9. RNA analys av polysomal fraktioner sedan tillåter mätning av förändringar i translationell påstår av enskilda mRNA av genome-wide omfattning och under olika fysiologiska förhållanden4,7, 10. metoden har även använts för att avslöja 5′ UTR och 3′ UTR sekvenser i kontroll av mRNA översättbarhet11roller, undersöka rollen som MicroRNA i translationell förtryck12, avslöja brister i ribosom biogenes13 , och förstå rollen av Ribosomen-associerade proteiner med mänskliga sjukdomar14,15. Under det senaste decenniet, har en växande roll för reglering av genuttryck under översättning framkommit som visar dess betydelse i mänskliga sjukdomar. Bevisen för translationell kontroll i cancer, metaboliska och neurodegenerativa sjukdomar är överväldigande15,16,17,18. Till exempel dysreglering av eIF4E-beroende translationell kontroll bidrar till autism med underskott15 och FMRP är involverad i spilta ribosomer på mRNA kopplade till autism14. Således är polysomal profilering ett mycket viktigt verktyg att studera defekter i translationell förordning i flera mänskliga sjukdomar.
Proteinanalys av polysomal fraktioner under olika fysiologiska förhållanden dissekerar funktionen av faktorer som förknippas med ribosomer under översättning. Polysome profilering tekniken har använts i många arter, inklusive jäst, däggdjursceller, växter och protozoer10,19,20,21. Protozo parasiter som Trypanosoma och Leishmania uppvisar begränsad transkriptionell kontroll av genuttryck. Deras genom är organiserade i polycistronic gen kluster som saknar arrangören-reglerade transkription22. Utvecklingsmässiga genuttrycket styrs istället huvudsakligen på nivå av protein översättning och mRNA-stabilitet i trypanosomatid arter23,24. Förståelse för translationell kontroll i avsaknad av Transkriptionsreglering är därför särskilt viktigt för dessa organismer. Polysomal profilering är ett kraftfullt verktyg att studera från reglering av genuttryck i Leishmania25,26,27,28.
De senaste framstegen i identifiering av enskilda mRNA nivåer av verklig tid kvantitativ PCR (RT-qPCR) och full transkriptom av nästa generations sekvensering, liksom proteomics teknik, ger upplösning och fördelarna med polysomal profilering till en ny nivå. Användningen av dessa metoder kan förlängas ytterligare genom analys av enskilda polysomal fraktioner av djupa RNA-sekvensering kombinerat med proteomiska analys övervaka translationell status av celler i genome-wide skala. Detta möjliggör identifiering av nya molekylära spelare reglera översättning under olika fysiologiska och patologiska förhållanden. Här presenterar vi en universell polysome profilering protokollet som används på tre olika modeller: den parasit Leishmania stora, odlade mänskliga celler och djurvävnader. Vi presenterar råd om förberedelse av cell lysates från olika organismer, optimering av lutningsförhållanden, val av RNase-hämmare och tillämpning av RT-qPCR, Western blot och RNA elektrofores för att analysera polysome fraktioner i denna studie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polysome fraktionering av sackaros lutning i kombination med RNA och proteinanalys av fraktioner är en kraftfull metod att analysera translationell status för enskilda mRNA eller hela translatome samt roller protein faktorer reglerar translationell maskiner som under normala fysiologiska eller sjukdom tillstånd. Polysomal profilering är en särskilt lämplig teknik för att studera translationell förordning i organismer såsom trypanosomatids inklusive Leishmania där transkriptionell kontroll är i stort s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Ching Lee för hjälp med ljudinspelning. Forskningen stöddes av de nystartade fonderna från Texas Tech University Health Sciences Center och av Center of Excellence för translationell neurovetenskap och Therapeutics (CTNT) bevilja PN-CTNT 2017-05 AKHRJDHW A.L.K.; delvis genom NIH grant R01AI099380 K.Z. James C. Huffman och Kristen R. Baca var CISER (centrum för Integration av STEM utbildning & forskning) akademiker och stöddes av programmet.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
References
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Capewell, P., et al. Regulation of Trypanosoma brucei Total and Polysomal mRNA during Development within Its Mammalian Host. PLoS One. 8 (6), e67069 (2013).
- Warner, J. R., Knopf, P. M., Rich, A. A multiple ribosomal structure in protein synthesis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 49, 122-129 (1963).
- Piccirillo, C. A., Bjur, E., Topisirovic, I., Sonenberg, N., Larsson, O. Translational control of immune responses: from transcripts to translatomes. Nature Immunology. 15 (6), 503-511 (2014).
- Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
- Masek, T., Valasek, L., Pospisek, M. Polysome analysis and RNA purification from sucrose gradients. Methods in Molecular Biology. 703, 293-309 (2011).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Zuccotti, P., Modelska, A. Studying the Translatome with Polysome Profiling. Methods in Molecular Biology. 1358, 59-69 (2016).
- Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), e15 (2017).
- Arava, Y., et al. Genome-wide analysis of mRNA translation profiles in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 100 (7), 3889-3894 (2003).
- Gandin, V., et al. nanoCAGE reveals 5′ UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Research. 26 (5), 636-648 (2016).
- Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
- Zanchin, N. I., Goldfarb, D. S. Nip7p interacts with Nop8p, an essential nucleolar protein required for 60S ribosome biogenesis, and the exosome subunit Rrp43p. Molecular Cell Biology. 19 (2), 1518-1525 (1999).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Gkogkas, C. G., et al. Autism-related deficits via dysregulated eIF4E-dependent translational control. Nature. 493 (7432), 371-377 (2013).
- Robichaud, N., Sonenberg, N. Translational control and the cancer cell response to stress. Curr Opin Cell Biol. 45, 102-109 (2017).
- Gordon, B. S., Kelleher, A. R., Kimball, S. R. Regulation of muscle protein synthesis and the effects of catabolic states. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 45 (10), 2147-2157 (2013).
- Ishimura, R., et al. RNA function. Ribosome stalling induced by mutation of a CNS-specific tRNA causes neurodegeneration. Science. 345 (6195), 455-459 (2014).
- Petersen, C. P., Bordeleau, M. E., Pelletier, J., Sharp, P. A. Short RNAs repress translation after initiation in mammalian cells. Molecular Cell. 21 (4), 533-542 (2006).
- Juntawong, P., Girke, T., Bazin, J., Bailey-Serres, J. Translational dynamics revealed by genome-wide profiling of ribosome footprints in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 111 (1), E203-E212 (2014).
- Bunnik, E. M., et al. Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Genome Biology. 14 (11), R128 (2013).
- De Gaudenzi, J. G., Noe, G., Campo, V. A., Frasch, A. C., Cassola, A. Gene expression regulation in trypanosomatids. Essays in Biochemistry. 51, 31-46 (2011).
- Alves, L. R., Goldenberg, S. RNA-binding proteins related to stress response and differentiation in protozoa. World Journal of Biological Chemistry. 7 (1), 78-87 (2016).
- De Pablos, L. M., Ferreira, T. R., Walrad, P. B. Developmental differentiation in Leishmania lifecycle progression: post-transcriptional control conducts the orchestra. Current Opinions in Microbiology. 34, 82-89 (2016).
- Soto, M., et al. Cell-cycle-dependent translation of histone mRNAs is the key control point for regulation of histone biosynthesis in Leishmania infantum. Biochemical Journal. 379, 617-625 (2004).
- McNicoll, F., et al. Distinct 3 ‘-untranslated region elements regulate stage-specific mRNA accumulation and translation in Leishmania. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35238-35246 (2005).
- Folgueira, C., et al. The translational efficiencies of the two Leishmania infantum HSP70 mRNAs, differing in their 3 ‘-untranslated regions, are affected by shifts in the temperature of growth through different mechanisms. Journal of Biological Chemistry. 280 (42), 35172-35183 (2005).
- Dumas, C., Chow, C., Muller, M., Papadopoulou, B. A novel class of developmentally regulated noncoding RNAs in Leishmania. Eukaryotic Cell. 5 (12), 2033-2046 (2006).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular Cell Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Karamyshev, A. L., Johnson, A. E. Selective SecA association with signal sequences in ribosome-bound nascent chains: a potential role for SecA in ribosome targeting to the bacterial membrane. Journal of Biological Chemistry. 280 (45), 37930-37940 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles. Bio Protocols. 7 (3), (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (1989).
- Patrick, A. E., Karamyshev, A. L., Millen, L., Thomas, P. J. Alteration of CFTR transmembrane span integration by disease-causing mutations. Molecular Biology of the Cell. 22 (23), 4461-4471 (2011).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO Journal. 33 (3), 265-276 (2014).
- Morita, M., et al. mTOR Controls Mitochondrial Dynamics and Cell Survival via MTFP1. Molecular Cell. 67 (6), 922-935 (2017).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
